β-磷酸三钙填充载药微球治疗兔感染性骨缺损△

乔永杰，张吕丹，李旭升，张浩强，甄 平，许瑞岭，叶 铄，周胜虎*，李 鹏，曹国定

（联勤保障部队第940医院a.关节外科；b.呼吸与危重症医学科，甘肃兰州730050）

感染性骨缺损的治疗是骨科领域的一大难点，目前应用于治疗感染性骨缺损的骨替代材料很多，主要包括有机和无机两种。前者包括聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥、聚乳酸/聚羟乙酸共聚物及聚羟乙酸等；后者包括载抗生素锻石膏、羟基磷灰石、磷酸三钙（tricalcium phosphate,TCP） 等［1，2］。研究表明，多孔 β-TCP支架复合抗菌药物不仅能控制感染，还能有效修复骨缺损［3，4］。慢性骨髓炎治疗周期长，材料在体内吸收溶解与新骨形成不平衡，致使缓释药物在局部浓度较低，因此临床治疗效果不佳。

慢性骨髓炎通常为金黄色葡萄球菌引起［5，6］，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA）感染引起的慢性骨髓炎逐渐增多，万古霉素作为治疗MRSA的经典药物，细菌的耐药性显著增强［7］。研究发现，利福平、异烟肼具有较好的抗细菌生物膜作用［8］。为此，本研究旨在采用利福平、异烟肼制备一种在其余抗生素无效情况下使用的抗生素缓释系统。

3D打印技术可构建与缺损骨组织相匹配的支架材料，还可精确调控支架内部孔隙结构，从而获得理想的骨修复效果［9］。本研究采用CAD软件设计并3D打印制备多孔β-TCP支架，并负载利福平、异烟肼/聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球，于动物实验中观察其抗菌作用及成骨作用。

1 材料与方法

1.1 材料制备与观察

1.1.1 支架制备

采用复乳化溶剂挥发法制备利福平、异烟肼/聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid,PLGA）缓释微球［10，11］。使用CAD计算机软件设计多孔 β-TCP 支架模型［12］，孔隙 400 μm，孔径 400 μm，小梁400 μm。采用离心震荡法制备负载利福平、异烟肼/PLGA缓释微球的多孔β-TCP支架［11，13］。

取冷冻后的复合支架，于扫描电镜下观察微球及支架表面形态、微球填充情况等，测定总孔隙率。取6个复合支架，采用万能材料力学试验机测量最大负荷及最大强度。

1.1.2 细菌制备

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ATCC33591）由联勤保障部队第940医院检验科提供，使用前采用麦氏比浊法制备成浓度为10×107CFU/ml的菌液。

1.2 动物分组与处理

成年雄性新西兰白兔75只，由甘肃中医药大学实验动物科提供。随机分为5组，每组15只。其中15只设为正常对照组，不接受骨髓炎模型制备处理；其余4组，共60只动物，参照邵陇龙等［14］的实验方法制备股骨下段慢性骨髓炎模型。4周时行钼靶X线片检查、细菌培养及病理学检查，观察模型制备是否成功［14，15］。

造模成功后，15只动物给予单纯清创（清创组）；15只动物给予清创后，骨缺损处分别植入利福平/异烟肼/PLGA缓释微球（药物组）；15只动物给予清创后，骨缺损处置入多孔β-TCP支架（支架组）；15只动物给予清创后，骨缺损处植入利福平/异烟肼/PLGA缓释微球/多孔 β-TCP支架（复合组）。分别于术后4、8、12周取材进行观测。

1.3 检测指标

1.3.1 钼靶X线检查

各时间点所有摄钼靶X线片，观察骨缺损愈合情况、有无死骨及骨硬化发生、局部炎症消散及材料在体内的分解情况。

1.3.2 组织学观察与评分

各时间点各组分别取3只动物，处死后取手术部位股骨髁，置于4%甲醛固定24 h，脱钙，石蜡包埋，切片，片厚4 μm。取部分切片常规HE染色，光镜下观察新骨生长情况、材料在体内变化及局部炎症情况。

1.3.3 MicroCT检测

各时间点各组取3只动物。当实验全部完成后，所有实验组动物标本进行Micro-CT检查。观察骨愈合、新骨生长及材料分解情况，并计算骨体积（bone volume,BV）、骨体积分数（bone volume fraction,BVF）、骨表面积（bone surface,BS）、骨小梁厚度 （trabecular thickness,Tb.Th） 和骨小梁数目（trabecular number,Tb.N）。

1.3.4 细菌培养

将各时间点组织学及Micro-CT观测剩余标本进行细菌培养。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 材料观察

扫描电镜观察，复合支架中缓释微球与支架粘合紧密，微球填充于支架之间的孔隙内。生物力学检测示，孔径为400 μm和小梁直径为400 μm的复合支架可达松质骨生物力学强度。

2.2 钼靶X线检查

术后4～12周各组均显示软组织肿胀逐渐减轻。清创组：骨缺损处无明显新骨生长。药物组：骨缺损处可见死骨块。支架组：骨缺损处可见少许骨质生长。复合组：复合支架融合满意，骨缺损处骨皮质连续，见图1。

图1 复合组钼靶X线检查所见 1a:术后8周，骨缺损开始修复，感染得到控制 1b:术后12周可见骨缺损修复完成，材料分解加速

2.3 组织学观察

术后4周到12周各组均显示炎症细胞浸润逐渐减轻，清创组：骨缺损处可见纤维组织充填。药物组：有新骨及血管生长。支架组：有新骨及血管生长。复合组：有较明显成骨现象，新生骨及血管生成满意。见图2。

2.4 MicroCT检测

清创组：术后骨缺损未见愈合倾向，无明显新骨生长。药物组：术后骨缺损仍较明显，部分局部炎症有所减轻。支架组：术后4周可见材料与骨组织融合，可见新生骨长入支架孔隙内；8周时可见材料在体内开始分解吸收；12周时开始快速分解。复合组：随时间延长，复合支架与骨组织融合满意，新生骨大量长入材料孔隙内，骨修复效果满意，见图3。

图3 复合组术后12周MicroCT扫描 3a:复合材料具有较强成骨作用，可见新生骨充满整个材料孔隙 3b:材料在术后12周分解加速

Micro-CT检测结果见表1。4～12周正常对照组的BV、BVF、BS、Tb.Th和Tb.N比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；随时间推移，4～12周清创组、药物组、支架组和复合组上述指标均有所增加，其中支架组和复合组上述指标呈线性增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。4～12周，BV、BVF、BS、Tb.Th和 Tb.N由高至低均依次为：正常对照组＞复合组＞支架组＞药物组＞清创组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 5组动物不同时间点股骨MicroCT检测结果（n=5，±s）与比较

表1 5组动物不同时间点股骨MicroCT检测结果（n=5，±s）与比较

images/BZ_61_205_383_535_453.pngBV（mm3）images/BZ_61_535_383_2276_453.pngimages/BZ_61_205_523_2276_593.pngimages/BZ_61_205_663_944_732.pngimages/BZ_61_1240_663_2276_732.pngimages/BZ_61_535_802_694_872.pngimages/BZ_61_944_663_1240_732.pngimages/BZ_61_205_802_535_872.pngBVF images/BZ_61_694_802_2276_872.pngimages/BZ_61_1240_942_1513_1012.pngimages/BZ_61_205_942_535_1012.pngimages/BZ_61_1513_942_1786_1012.pngimages/BZ_61_535_942_944_1012.pngimages/BZ_61_1786_942_2060_1012.pngimages/BZ_61_944_942_1240_1012.pngimages/BZ_61_2060_942_2276_1012.pngimages/BZ_61_694_1082_944_1152.pngBS （mm2）images/BZ_61_535_1082_694_1152.pngimages/BZ_61_944_1082_2276_1152.pngimages/BZ_61_694_1222_1240_1292.pngimages/BZ_61_205_1082_535_1152.pngimages/BZ_61_1240_1222_2276_1292.pngimages/BZ_61_944_1362_1240_1432.pngimages/BZ_61_205_1362_694_1432.pngTb.Th（μm）images/BZ_61_1240_1362_1513_1432.pngimages/BZ_61_694_1362_944_1432.pngimages/BZ_61_1513_1362_1786_1432.pngimages/BZ_61_205_1222_535_1292.pngimages/BZ_61_1786_1362_2276_1432.pngimages/BZ_61_944_1502_1240_1572.pngimages/BZ_61_205_1502_694_1572.pngimages/BZ_61_1513_1502_1786_1572.pngimages/BZ_61_694_1502_944_1572.pngimages/BZ_61_1240_1502_1513_1572.pngimages/BZ_61_1786_1502_2276_1572.pngimages/BZ_61_944_1641_1513_1711.pngimages/BZ_61_535_1222_694_1292.pngimages/BZ_61_535_1641_944_1711.pngimages/BZ_61_1513_1641_1786_1711.png4周12周4周12周4周12周4周12周4周12周images/BZ_61_1786_1641_2276_1711.pngimages/BZ_61_1240_1781_1513_1851.png4.45±0.55 6.63±0.29 0.06±0.01 0.07±0.02 18.86±2.78 21.15±2.41 0.73±0.11 0.93±0.07 0.42±0.05 0.56±0.05images/BZ_61_535_1781_944_1851.png＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001images/BZ_61_205_1641_535_1711.pngTb.N（1/mm）images/BZ_61_944_1781_1240_1851.png＜0.001＜0.001 6.52±0.66 7.91±0.59 0.05±0.01 0.09±0.01 25.69±4.71 30.02±4.30 0.91±0.11 0.93±0.16 0.52±0.10 0.79±0.16 11.78±0.99 22.17±1.01 0.10±0.02 0.20±0.02 39.15±5.31 73.64±9.56 0.89±0.12 1.08±0.17 0.85±0.11 1.89±0.16images/BZ_61_1513_1781_1786_1851.pngimages/BZ_61_205_1781_535_1851.png13.09±0.97 33.45±1.05 0.18±0.02 0.27±0.02 39.99±3.84 103.42±7.87 1.01±0.15 1.01±0.16 1.10±0.11 2.90±0.08images/BZ_61_1786_1781_2060_1851.png36.46±1.73 34.81±1.16 0.31±0.02 0.31±0.02 116.33±6.53 120.69±6.48 1.09±0.20 1.16±0.39 3.20±0.11 3.22±0.09＜0.001 0.429images/BZ_61_2060_1781_2276_1851.png

2.5 细菌培养

术后4周，清创组实验动物均培养到MRSA；药物组2只动物培养阳性；支架组动物全部培养阳性；复合组1只动物培养阳性。术后8周，清创组1只培养阳性；其余3组均未培养到MRSA。术后12周，4组动物均未培养到细菌。

3 讨论

PMMA载抗生素骨水泥广泛应用于骨髓炎的治疗且疗效确切［16，17］。但PMMA不能在体内吸收溶解，增加了细菌再次感染的可能性，而且在局部释放药物浓度较低。生物材料如β-TCP、硫酸钙（CaSO4）、羟基磷灰石（HA）、硅酸盐生物活性玻璃等，由于与机体相容性好被广泛应用于骨组织工程［18，19］。β-TCP 支架复合利福平、异烟肼缓释微球是一种具有良好生物相容性和机械性能的材料，且具有良好的抑菌效果，药物缓释持续时间长可有效杀灭残存的细菌，基本能达到治疗慢性骨髓炎的标准。袁景［11］和孟磊［13］研究显示复合材料在体内对动物无明显肝肾毒性，具有良好的生物相容性，可作为治疗慢性骨髓炎的骨替代材料。

本研究术后影像学检查结果示：清创组不能控制感染且没有明显的新骨生长，可能与清创不彻底及骨质缺损较大有关；药物组有一定的抗感染作用，但没有明显的新骨生长，可能与骨质缺损较大，不具有支架桥梁作用，无法完成骨修复；支架组有一定的骨修复作用，但因局部没有抗菌药物，无法完成抗感染作用；复合组能观察到良好的抗感染作用且新骨生长效果良好，进一步证明该材料的优越性。以往采用羟基磷灰石、硫酸钙骨水泥、万古霉素骨水泥等，均能达到优良的抗菌作用，但往往成骨作用较弱［20，21］。分析其原因，可能为：（1）形成复合材料后微球与介质的接触面积减少，延缓了微球的降解过程；（2）复合材料无免疫原性且具备良好生物相容性、持续骨诱导能力，可有效促进骨细胞长入；（3）复合材料具有药物缓释和序贯控释的特性，同时具有良好的孔隙率和细胞相容性。

术后病理学观察，清创组转为慢性感染，无明显好转现象，因局部无抗感染作用引起；药物组炎症较清创组稍好转，但骨缺损无明显好转，有缓释微球但无支架桥梁，无法完成骨修复；支架组转为慢性感染，因无抗菌作用，骨缺损部位有骨质生长，但效果不佳；复合组既有局部抗感染，又有支架桥梁，可见炎症逐渐消散，并且骨质生长良好。细菌培养也显示缓释微球有良好的抗菌作用，证明该抗生素对MRSA疗效显著。研究表明，β-TCP具有良好的成骨作用，但以往均负载传统抗生素［4，22］，后期往往产生耐药，骨髓炎的治疗效果不佳。该研究显示利福平、异烟肼具有优良的抗菌及成骨作用，可能和如下因素相关：（1）复合材料的利福平、异烟肼降解速率可能与新骨生成具有较好的匹配性，复合材料具有较好的机械性能，提供即时的稳定性同时，利于成骨细胞增殖，提高骨修复能力；（2）复合材料在抗感染的同时，具有较低的细胞毒性，宏观及微观互相连通的开放孔隙有利于体内组织内生长；（3）复合材料的降解能为新骨的形成提供更丰富的钙离子和磷离子，促进新骨形成，并逐步为新骨组织置换。

综上所述，3D打印β-磷酸三钙支架复合利福平、异烟肼缓释微球构成的复合材料有较好的抗MRSA作用及良好的成骨作用，是一种具有潜力的治疗感染性骨缺损的材料。