环状RNA has_circ_0067923促进氧糖剥夺所致SH-SY5Y细胞凋亡的作用机制研究

吴冠瑾，闫福岭，刘琛，张川，秦树巧，冯静静，黑丹丹

1.河南大学附属郑州颐和医院神经内科，河南 郑州 450047；2.东南大学附属中大医院神经内科，江苏 南京 210009；3.郑州人民医院感染管理办公室，河南 郑州 450000

脑卒中(cerebral stroke)是导致全球人类高死亡率和高致残率的重要因素[1]。缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke)占脑卒中的80%以上。目前，对于缺血性卒中患者，主要的治疗方式是通过阻塞性动脉的溶栓和/或机械再通来尽早实行再灌注。然而，这些治疗方式由于治疗时间窗狭窄，出血风险等因素[2]，导致治疗效果并不理想。因此，深入了解缺血性脑卒中的发病机制，研发新的治疗手段，具有重要的临床意义。近年来，非编码RNA(ncRNA)在中枢神经系统的正常和病理状态下均起着至关重要的作用[3-6]。环状RNA(circRNA)是一种重要的非编码RNA，其3'和5'末端之间具有共价键，从而形成环状结构[7]，circRNA在人类细胞中高度保守并大量表达[8]。近年来的研究表明，短暂性脑局部缺血、氧气-葡萄糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)均能促使神经元细胞中circRNA表达谱发生显著的改变[9]，但具体的调控机制还有待深入研究。本研究利用SH-SY5Y细胞建立OGD损伤模型，初步探讨has_circ_0067923在OGD导致的SH-SY5Y细胞增殖及凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及试剂 SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞购自中国科学院细胞库。Cell Counting Kit-8试剂盒、Annexin V-FΙTC检测试剂盒、胰酶细胞消化液(0.25%胰酶)、RΙPA细胞快速裂解液、BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；MEM/F12培养基、无糖MEM/F12培养基、Lipofectamine 3000转染试剂、胎牛血清、TRΙzol购自美国Thermofisher；PrimeScript™RT Reagent Kit、TB Green Fast qPCR Mix购自日本TaKaRa公司；PVDF膜、化学发光试剂购自美国Millipore公 司；Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3及GAPDH抗体购自中国Proteintech公司；HRP酶标抗兔二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；引物及si-NC、si-has_circ_0067923序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他试剂为国产分析纯。

1.1.2 仪器 MK3酶标仪购自芬兰雷勃公司；Mini Protean 3 Cell电泳仪购自美国BΙO-RAD公司；CFX-96荧光定量PCR仪购自美国BΙO-RAD公司；Tanon-5200全自动化学发光分析仪购自上海天能科技有限公司；细胞培养箱购自美国Thermofisher；NovoCyteTM流式细胞仪购自Novo公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SH-SY5Y细胞复苏后，利用含有10%胎牛血清(FBS)的MEM/F12培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞黏合度达到90%以上的时候，按照1∶(2～3)的比例传代，备用。

1.2.2 细胞分组 将SH-SY5Y细胞随机分成Control组(正常培养基，常氧培养)、OGD处理组；除Control组外，OGD(2 h)组、OGD(4 h)组、OGD(6 h)组均通过OGD处理不同时间点。检测细胞的增殖、凋亡及has_circ_0067923表达变化。

1.2.3 SH-SY5Y细胞OGD模型构建 取处于对数生长期的SH-SY5Y细胞，按照1×104cells/mL的细胞量传于6孔板，构建OGD模型：首先弃去原有培养基后，利用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3次，每孔加入无血清、无糖MEM培养基1.5 mL，置于37℃、5%CO2、94%N2、1%O2的三气培养箱中进行氧糖剥夺相应时间点后，取出细胞，换成正常培养基，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h。

1.2.4 细胞转染 取处于对数生长期的SH-SY5Y细胞，按照1×104cells/mL的细胞量传于6孔板，参照转染试剂盒操作说明书，利用Lipofectamine 3000转染试剂将si-has_circ_0067923及si-NC片段传染SH-SY5Y细胞。转染24 h后，构建OGD模型。其中si-has_circ_0067923序列和si-NC序列分别为5'-GCCACAGUGUUCCCUUGUGUA-3'、5'-AUUAUC UGGCUUAAAUUGCCA-3'。

1.2.5 细胞增殖能力检测 OGD造模，换成正常培养基在常氧下继续培养24 h后，按照试剂盒操作说明，每孔加入10μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育0.5 h，用酶标仪(450 nm)检测各组细胞的吸光值(OD值)。

1.2.6 细胞凋亡检测 OGD造模，换成正常培养基在常氧下继续培养24 h后，按照试剂盒操作说明，加入5μLAnnexin V-FΙTC及10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，室温避光孵育10～20 min，随后置于冰浴中，流式细胞仪上机检测，NovoExpressTM分析软件进行分析。

1.2.7 qRT-PCR检测 收集细胞，TRΙzol裂解提取RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit逆转录程cDNA后进行qRT-PCR检测，引物序列见表1。反应程序：95℃，3 min；95℃，5 s；59℃，10 s；72℃，25 s；39 cycles；65℃，5 s；95℃，50 s。以GAPDH为内参，利用2-ΔΔCT计算has_circ_0067923相对表达量。

表1 引物序列

1.2.8 has_circ_0067923结构及表达位置分析 利用circPrimer1.2分析has_circ_0067923的结构。采用Rnase R处理SH-SY5Y细胞后，收集细胞，Trizol法提取RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit逆转录程cDNA后，qRT-PCR检测has_circ_0067923表达。内参选用GAPDH、U6及18S(引物序列见表1)。

1.2.9 Western blot检测 收集细胞，RΙPA裂解后，冰上孵育20 min后，4℃、10 000×g离心3～5 min，取上清，BCA定量后，按照每孔20μg蛋白量上样，SDS-PAGE电泳后，转膜，分别以兔抗Bax(1∶800)、Bcl-2(1∶1 000)、CleavedCaspase-3(1∶800)及GAPDH(1∶10 000)，4℃、孵育过夜后，TBST漂洗3次，加入HRP酶标抗兔二抗。加入ECL发光液膜置于全自动化学发光分析仪中扫描，通过TANON GΙS软件读取相关条带灰度值。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件分析数据，采用GraphPad Prism6.0作图。计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间数据的比较采用One-way ANOVA分析，组内两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OGD抑制SH-SY5Y细胞增殖、促进细胞凋亡 OGD处理不同时间后，SH-SY5Y细胞活力均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1A。Annexin V-FΙTC/PΙ检测分析发现：Control组细胞凋亡率为(5.19±0.19)%、OGD(2 h)细胞凋亡率为(16.45±1.57)%、OGD(4 h)细胞凋亡率为(26.62±1.56)%、OGD(6 h)细胞凋亡率为(33.13±2.39)%，OGD显著促进SH-SY5Y细胞凋亡(P＜0.05)，见图1B～1F。

2.2 OGD促进SH-SY5Y细胞中has_circ_0067923表达 circPrimer1.2分析发现，has_circ_0067923位于3号染色体，亲本基因为PRKCΙ(protein kinase Ciota)，其大小为278 bp(图2A)。qRT-PCR检测分析发现，随着OGD时间的延长，has_circ_0067923表达显著升高(P＜0.05)，见图2B。qRT-PCR检测分析发现，has_circ_0067923主要存在于细胞质中(图2C、2D)。

图1 OGD处理后，SH-SY5Y细胞增殖及凋亡检测

图2 qRT-PCR检测has_circ_0067923的表达及定位

2.3 has_circ_0067923促进OGD对SH-SY5Y细胞的损伤 特异性抑制has_circ_0067923的表达后，通过检测发现：与OGD组比较，si-has_circ_0067923显著促进SH-SY5Y细胞的增殖(P＜0.05)(图3A)；Control组细胞凋亡率为(5.81±0.79)%、OGD组细胞凋亡率为(18.41±0.69)%、si-NC组细胞凋亡率为(18.59±1.40)%、si-has_circ_0067923组细胞凋亡率为(27.44±1.79)%，与OGD组比较，si-has_circ_0067923组显著抑制OGD引起的SH-SY5Y细胞凋亡(P＜0.05)。说明OGD促进SH-SY5Y细胞凋亡，抑制细胞增殖的作用与has_circ_0067923的表达相关(图3B～3F)。

图3 has_circ_0067923抑制后，细胞增殖及凋亡检测

2.4 Western blot检测凋亡相关蛋白Bad、Bcl-2及Cleaved Caspase-3的表达 Westernblot检测发现：与Control组比较，Bad及Cleaved Caspase-3的表达量在OGD组、si-NC组、si-has_circ_0067923组中的表达量均显著升高(P＜0.05)；与OGD组比较，has_circ_0067923的表达被抑制后，Bad、Cleaved Caspase-3的表达量均显著降低(P＜0.05)。Bcl-2在OGD组、si-NC组、si-has_circ_0067923组中的表达量显著降低(P＜0.05)；与OGD组比较，has_circ_0067923的表达被抑制后，Bcl-2的表达量被显著升高(P＜0.05)，见图4。

图4 Westernblot检测Bad、Bcl-2及Cleaved Caspase-3的表达

3 讨论

脑卒中是引起人类死亡的重要原因之一[1]。近年来，中国脑卒中的患病率处于上升趋势，特别是在农村地区[1]。脑卒中的年龄标准化的患病率，发病率和死亡率分别为1 114.8/100 000、246.8/100 000和114.8/100 000[10-11]。脑卒中主要是由于流向大脑的血液不足导致神经细胞死亡，并出现诸如运动功能障碍、语言表达能力障碍或失明等症状[11]。缺血性脑卒中是其主要表现形式，最终导致神经元细胞肿胀和凋亡[12]。CricRNA是基因组重要组成部分，其表达的改变与多种病理、生理过程及疾病的发生发展相关[13]。本研究我们检测分析发现，在SH-SY5Y细胞OGD损伤中，has_circ_0067923的表达显著升高，抑制其表达后，能够降低OGD处理对SH-SY5Y细胞增殖及凋亡的影响，暗示has_circ_0067923可能参与缺血性脑卒中的发生。

CircRNA是一类在真核动物体内广泛表达的内源性非编码RNA，来源广。目前研究发现的CircRNA大部分是由外显子反向剪切形成，在人类疾病发生过程中发挥着重要的生物学功能[13]。CricRNA可控制亲本基因的转录，促进环状翻译，促进mRNA的选择性剪接和发挥miRNA海绵等作用[14]。CircRNA的表达改变参与肿瘤、心肌肥大、动脉粥样硬化和神经退行性疾病等疾病的发生[15-19]。转录组测序的结果分析发现，缺血性脑卒中大鼠大脑皮层中14 236个CricRNA的表达水平发生改变，参与缺血性脑组织的损伤[20]。本研究通过利用SH-SY5Y细胞建立体外缺血性卒中损伤的OGD模型，检测发现：随着OGD处理时间的延长，has_circ_0067923的表达量逐渐升高，细胞增殖能力被抑制，促进细胞凋亡；抑制has_circ_0067923表达后，能够逆转OGD处理对细胞的损伤作用，暗示has_circ_0067923参与OGD处理对SH-SY5Y神经元细胞的损伤。

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，主要受基因及细胞生存的环境因素所控制。Caspase-3是促凋亡蛋白家族Caspase家族重要的成员之一。在细胞中，Caspase大多是以酶原的形式所存在的，但当它被激活后能够通过活化自身及其他相关的Caspase酶原，启动会相关蛋白酶的级联反应过程，从而放大凋亡的信号，导致细胞凋亡的发生。活化的Caspase3蛋白能够降解细胞膜、细胞质及细胞核中的重要蛋白，从而使之失去活性，最终导致凋亡的发生。抗凋亡蛋白Bcl-2可通过阻止促凋亡蛋白bad介导的促凋亡因子的释放而抑制细胞凋亡[21]。与既往研究类似，本研究发现OGD处理促进SH-SY5Y细胞Caspase-3及Bad的表达、降低Bcl-2蛋白的表达，进而促进细胞凋亡[22-23]。抑制has_circ_0067923的表达后，能够逆转OGD处理对Caspase-3、Bad及Bcl-2表达的影响。初步说明has_circ_0067923可能通过调控细胞凋亡参与OGD处理对SH-SY5Y神经元细胞的损伤。

综上所述，本研究初步说明，has_circ_0067923的表达异常，参与OGD处理对SH-SY5Y神经元细胞的损伤，促进神经元细胞凋亡，抑制细胞增殖；抑制has_circ_0067923表达后，能够缓解氧糖剥夺对SH-SY5Y细胞损伤。但has_circ_0067923调控OGD处理对神经元细胞损伤的具体作用机制，有待更深入研究。