双嘧达莫纳米混悬剂的制备与药物溶出研究

刘 磊

(大连市第三人民医院药剂部，大连 116033)

双嘧达莫(DPM)为磷酸二酯酶可逆性抑制剂，具有扩张冠脉及抗血栓形成作用，临床主治中风术后并发症以及心脏手术或瓣膜置换术等[1-2]。DPM为生物药剂学分类系统(BCS)Ⅱ类药物，解离常数pKa为6.4，属于弱碱性药物[3]，药物溶解性具有pH依赖性，在酸性(pH值1～4)环境中药物溶解度较高，在pH 7.0介质中溶解度仅为5 μg·mL-1[4]，这会导致已经溶解在胃液中的DPM随着胃排空进入小肠时会析出沉淀[5]，个体间生物利用度差异性较大(18%～43%)[6]，临床疗效不确切。纳米混悬剂(NPs)以少量高分子聚合物和/或表面活性剂作为稳定剂，通过机械性超微粉碎技术或控制结晶析出条件将药物制备成粒径小于1 000 nm且具有良好物理稳定性的胶体分散体[7-9]，NPs粒径较小，将药物制备成NPs后能显著增加药物的溶解度和生物利用度[10-11]。本研究将DPM制备成DPM-NPs，并通过模拟体内药物溶出实验，为DPM的体内药动学研究奠定实验基础。

1 仪器与材料

1.1仪器 FA25型高剪切分散乳化机(上海右一仪器有限公司)；PSI-20型高压微射流均质机(上海奥法美嘉生物科技有限公司)；Zetasizer Nano ZSP型动态光散射粒度分析仪(英国马尔文公司)；RC-8DA型药物溶出试验仪(天津创兴电子设备制造股份有限公司)；KYKY-EM8000型扫描电子显微镜(北京中科科仪股份有限公司)。

1.2试药 双嘧达莫原料药(亚宝药业集团股份有限公司，批号S190817，质量分数为99.5%)；羟丙甲纤维素E5(HPMC E5，陶氏化学中国有限公司)；羟丙基纤维素EXF(HPC EXF)和聚维酮K30(PVP K30)，均购自亚什兰中国投资公司；吐温-80(P80，南京威尔药业股份有限公司)；泊洛沙姆188(F68，巴斯夫中国有限公司)；甘露醇(罗盖特连云港有限公司)。

2 方法与结果

2.1DPM-NPs的制备 采用高压均质法制备DPM-NPs。制备工艺：称取经气流粉碎机处理过的DPM原料药[颗粒累积分布为90%的粒径(D90)为10.2 μm，颗粒累积分布为50%的粒径(D50)为4.1 μm，颗粒累积分布为10%的粒径(D10)为1.6 μm]1.0 g加入到含有稳定剂的纯化水中，介质体积为100 mL，搅拌分散均匀；通过高剪切分散乳化机高速剪切10 min，转速为20 000 r·min-1，初步减小DPM粒径，再将DPM分散液通过高压微射流均质机高压均质处理，在一定的均质压力和均质次数下均质，即得DPM-NPs。取DPM-NPs 2.5 mL，置于10 mL西林瓶中，加入甘露醇溶解，使甘露醇质量浓度为50 mg·mL-1，将样品置于冷冻干燥机中冻干处理，干燥结束后加塞密封保存，备用。

2.2DPM-NPs处方考察

2.2.1稳定剂种类考察 研究表明[12]，NPs处方中通常单独加入HPC EXF、HPMC E5和PVP K30等高分子材料，或与表面活性剂F68、P80联合使用作为稳定剂，以增加纳米混悬剂的稳定性。本研究采用单因素实验筛选方法，以制备的DPM-NPs粒径大小、多聚分散系数(PDI)以及Zeta电位和稳定性(通过肉眼观察)作为评价指标，在相同的制备工艺条件下考察了不同种类稳定剂对DPM-NPs性质的影响，结果见表1。

表1 稳定剂的筛选结果

NPs为热动力学不稳定体系，稳定剂的加入一方面可以降低界面张力，使颗粒表面充分润湿，另一方面稳定剂通过空间位阻或静电斥力作用抑制颗粒聚集[13]。由表1可知，以PVP K30与F68组合使用制备的DPM-NPs粒径最小，PDI及Zeta电位值相对较低，放置24 h未出现絮状沉淀。因此选择PVP K30和F68作为DPM-NPs的稳定剂作进一步研究。

2.2.2稳定剂质量浓度筛选 根据前期预实验结果，选择PVP K30质量浓度为5、10 mg·mL-1，F68质量浓度为0.5、1.0 mg·mL-1，采用交叉实验方法，在相同的制备工艺条件下考察稳定剂质量浓度对DPM-NPs性质的影响，结果见表2。

表2 稳定剂质量浓度的筛选结果

由表2可知，PVP K30质量浓度对DPM-NPs粒径分布的影响较显著，当PVP K30质量浓度为5 mg·mL-1时，制备的DPM-NPs粒径较大，当PVP K30质量浓度增加到10 mg·mL-1时，制备的DPM-NPs粒径较小，因此确定DPM-NPs处方中稳定剂PVP K30的质量浓度为10 mg·mL-1，F68的质量浓度为0.5 mg·mL-1。

2.3制备工艺优化

2.3.1实验设计 前期预实验研究表明，高压均质法工艺参数对DPM-NPs的粒径有较大影响，因此本研究通过实验设计优化高压均质工艺参数。以均质压力(X1)和均质次数(X2)作为变量因素，以制备的DPM-NPs粒径分布(Y)作为评价指标，采用“中心复合实验设计”优化得到制备DPM-NPs的最佳工艺参数。因素与水平见表3，实验设计与结果见表4。

表3 中心复合实验设计因素与水平

2.3.2模型建立与统计分析 采用“中心复合实验设计”实验软件对表4中的实验数据进行统计分析，以评估均质压力和均质次数对DPM-NPs粒径分布的影响程度，结果见表5。由表5可知，模型P值为0.000 6，小于0.05，说明模型显著，可用该模型进行分析和预测；失拟项P值为0.250 2，大于0.05，说明实测值和预测值比较差异无统计学意义，模型预测准确度较高。建立的二元多次拟合方程模型为：Y=510.57-149.13X1-78.58X2+47.78X1X2+120.38X12+8.63X22(R2=0.973 4)，其中X1、X2、X1X2和X12的P值均小于0.05，对粒径具有显著影响。通过绘制效应面图可直观分析均质压力和均质次数及其相互作用对DPM-NPs粒径分布的影响，见图1。

表4 实验设计与结果

表5 方差分析结果

图1 均质压力(X1)和均质次数(X2)对DPM-NPs粒径分布(Y)的效应面图

由图1可知，当均质压力恒定时，随着均质次数的增加，DPM-NPs的粒径呈减小趋势；当均质次数恒定时，随着均质压力的增加，DPM-NPs的粒径呈减小趋势。

本研究要求制备的DPM-NPs粒径分布趋于最小化，经软件优化得到的最佳制备工艺参数为：均质压力为18 000 psi，均质8次，预测得到DPM-NPs的粒径大小为449.5 nm。根据最佳均质工艺参数制备DPM-NPs，测得粒径分布为(438.6±24.7)nm，误差均在5%以内，实验测定值与预测值接近，说明使用“中心复合实验设计”优化DPM-NPs制备工艺准确度较高。

2.4DPM-NPs冻干前后表征

2.4.1粒径分布及Zeta电位测定 采用Zetasizer Nano ZSP动态光散射粒度分析仪测定冻干前DPM-NPs溶液以及该批样品冻干复溶后的粒径分布、PDI及Zeta电位，比较冻干前后DPM-NPs的粒径分布、PDI及Zeta电位是否发生变化，结果见表6。

表6 DPM-NPs冻干前后的理化性质

由表6可知，DPM-NPs在冻干前后的粒径分布、PDI及Zeta电位均未发生显著变化，说明冷冻干燥能够保持DPM-NPs原有的理化性质，有效避免其聚集，稳定性良好。

2.4.2微观形貌 取冻干前及复溶后的DPM-NPs溶液适量，滴加到锡箔纸上，挥干水分，黏附到双面带有碳胶带的电胶布上，喷金，在扫描电镜下观察其微观形貌，见图2。由图2可知，冻干前后DPM-NPs均呈不规则状态分布，冷冻干燥未改变DPM-NPs的微观结构。

图2 DPM-NPs冻干前(A)及复溶后(B)的扫描电镜图

2.5模拟体内药物溶出研究 已有研究表明，采用胃肠道特定部位的模拟液进行生物相关的溶出度实验是预测难溶药物吸收的一种有效方法[14-15]，因此本研究比较DPM-NPs和DPM片在模拟人工胃液(SGF)和模拟人工肠液(SIF)中的药物溶出度情况。介质溶液体积为500 mL，搅拌桨转速为50 r·min-1，分别取DPM-NPs和DPM片加入到溶出杯中，分别在5、10、20、30、45、60 min取样5 mL(同时补加等温释放介质5 mL)，离心10 min，取上清液，经HPLC法[16]测定DPM的含量，并计算溶出度，绘制DPM-NPs与DPM片在SGF和SIF中的溶出曲线。见图3。

图3 DPM-NPs和DPM片在SGF和SIF中的溶出曲线

由图3可知，DPM-NPs和DPM片在SGF中60 min内溶出度均达到了90%以上，这是由于DPM在SGF(pH值为1.5)介质中具有较高的溶解性，而在SIF(pH值为6.8)介质中，DPM-NPs和DPM片的溶出度呈降低趋势，这是由于DPM在中性环境中溶解性较差，不利于药物溶解[17]；同时也观察到DPM-NPs在SGF和SIF介质中的药物溶出速度均明显高于DPM片，这是由于DPM-NPs粒径较小，比表面积较大，加快了药物溶出。通过模拟体内药物溶出实验可初步判断DPM-NPs能够提高药物在胃肠道溶液中的溶出速度，有望减小药物口服吸收变异性，提高生物利用度。

3 讨论

高压均质技术是在高压作用下将原料药以极大的速度流经微管通道，并进入微米级固定均质腔，在此过程中大粒径的原料药受到高剪切力、高碰撞力和空穴效应等综合作用使其粒径减小，可以通过精确调节均质压力以获得稳定的剪切力[18]，确保制备的NPs粒径大小分布均匀，因此本研究采用高压均质技术制备DPM-NPs。

NPs的处方中需要加入稳定剂来降低固-液界面表面张力，避免聚集、团聚和沉降等现象[19]，常用的稳定剂包括高分子化合物和表面活性剂，表面活性剂通过降低药物与介质之间的表面张力，在原料药粒径减小时介质能够充分润湿其表面，极大降低了微粒之间的吸附性，而高分子化合物很快分散并吸附在药物微粒表面，形成一层类似于膜的结构，可以提供空间位阻作用，两者共同作用可有效避免粒子间的相互聚集作用。本研究通过对DPM-NPs稳定剂种类的筛选，最终确定PVP K30和F68作为稳定剂能够有效防止NPs聚集沉淀，能使其长时间保存。