HPLC法同时测定渴乐宁胶囊中7种成分及聚类分析

张 凯，韦 杏

(1.辽宁中医药大学附属医院药学管理部，沈阳 110032；2.广西中医药大学，南宁 530001)

糖尿病在中医学上属于“消渴病”范畴，是因胰岛素分泌或利用缺陷引起的代谢性疾病，可引起多系统损害，导致眼、肾、神经、心脏、血管等组织器官出现慢性进行性病变、功能减退及衰竭，严重危害患者的身心健康。采用中药及其制剂的中医治疗方法能够有效避免胰岛素等化学药物治疗所引起的毒性和不良反应，安全性好。渴乐宁胶囊由黄芪、酒炙黄精、太子参、地黄和天花粉5味药材组方而成，以达益气养阴、生津止渴之效，对口渴多饮、五心烦热、乏力多汗和心慌气短等证候属气阴两虚所致的消渴病或2型糖尿病临床疗效确切[1]。现代研究表明，渴乐宁胶囊可降低正常小鼠和四氧嘧啶糖尿病大鼠的血糖水平，具有较强的耐糖作用，能够对抗外源性葡萄糖引起的血糖升高，延长甲亢阴虚型小鼠常压缺氧存活时间[2]；可有效调节气阴两虚型糖尿病患者的血糖，改善患者的糖化血红蛋白和空腹血糖水平，增强患者的血糖控制效果，降低发生高胰岛素血症的风险[3]；其联合二甲双胍、格列齐特和甘舒霖30R可有效控制患者的血糖水平，降低机体炎症反应，改善机体瘦素、皮质醇和脂联素水平，对2型糖尿病治疗效果显著[4-6]。渴乐宁胶囊现收载于《中国药典》2020年版一部[1]，质量标准和相关文献[7]仅对黄芪甲苷进行了定量研究，中药复方制剂具有成分复杂繁多性、疗效协同整体性等特点，多成分质量控制模式已成为中成药复方制剂的发展趋势，为更加全面科学地评价渴乐宁胶囊整体质量，本实验采用HPLC法对渴乐宁胶囊君药黄芪[8-9]中的主要成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素，臣药太子参[10-12]代表性成分太子参环肽B，佐药地黄[13-15]主要药效成分梓醇、地黄苷D和益母草苷的含量进行同时测定，并采用聚类分析法对检测结果进行综合评价，以期为全面评价渴乐宁胶囊的整体质量提供数据支持。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；AUW-220D型电子天平(美国Shimadzu公司)；KQ-250DV型超声波清洗器(昆山市舒美超声仪器有限公司)。

1.2试药 对照品：毛蕊异黄酮葡萄糖苷(质量分数为96.8%，批号111920-201907)，中国食品药品检定研究院；太子参环肽B(质量分数为99.9%，批号PRF16012101)，梓醇(质量分数为99.9%，批号PRF8052221)，地黄苷D(质量分数为97.6%，批号PRF10012243)，益母草苷(质量分数为94.4%，批号PRF9103142)，芒柄花苷(质量分数为99.6%，批号PRF8081121)和芒柄花素(质量分数为99.9%，批号PRF8091225)，均购自成都普瑞法科技开发有限公司。渴乐宁胶囊(规格：0.45 g·粒-1，批号：190803、190807、190816、190902、191101、191103、200216、200219、200302、200305，编号依次为S1～S10)，购自威海华洋药业有限公司。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1混合对照品溶液 精密称取7种成分对照品各适量，用甲醇制成质量浓度分别为0.114、0.958、0.332、0.494、0.416、0.238、0.852 mg·mL-1的混合对照品储备液。精密吸取上述混合对照品储备液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用甲醇定容至20 mL，制成系列混合对照品溶液Ⅰ～Ⅵ；取混合对照品溶液Ⅲ作为混合对照品溶液(7种成分质量浓度分别为5.7、47.9、16.6、24.7、20.8、11.9、42.6 μg·mL-1)。

2.1.2供试品溶液 精密称取渴乐宁胶囊内容物细粉1.0 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇适量，超声45 min，放冷后用甲醇定容，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3阴性样品溶液 按照渴乐宁胶囊质量标准项下处方比例及制法制备缺太子参、地黄和黄芪的阴性样品各适量，按照2.1.2项下方法制成阴性样品溶液。

2.2色谱条件及专属性实验 以乙腈(A)-2 mL·L-1磷酸(B)为流动相，梯度洗脱(0～13.0 min，15.0%A；13.0～19.0 min，15.0%A～25.0%A；19.0～35.0 min，25.0%A～42.0%A；35.0～52.0 min，42.0%A～67.0%A；52.0～60.0 min，67.0%A～15.0%A)。流速：0.9 mL·min-1；采用Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：210 nm 0～35.0 min检测太子参环肽B、梓醇、地黄苷D和益母草苷[16-20]，254 nm 35.0～60.0 min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素)[21]。精密吸取2.1.1项下制备的混合对照品溶液、2.1.2项下制备的供试品溶液和2.1.3项下制备的阴性样品溶液各10 μL，进样检测并记录色谱图，见图1。

图1 HPLC图

结果显示，渴乐宁胶囊中7种成分与相邻色谱峰均能有效分离(分离度>1.5)；阴性样品对渴乐宁胶囊中7种成分的同时测定无干扰；理论塔板数按各成分色谱峰计算均≥3 500。

2.3线性关系实验 精密吸取2.1.1项下制备的系列混合对照品溶液Ⅰ～Ⅵ各10 μL，按照2.2项下色谱条件进样测定渴乐宁胶囊中7种成分的峰面积，以峰面积为纵坐标(y)、7种成分质量浓度为横坐标(x)进行线性回归，结果见表1。

表1 7种成分的回归方程、相关系数和线性范围

2.4精密度实验 取2.1.1项下制备的混合对照品溶液，连续进样6次，测得7种成分峰面积的RSD值分别为1.08%、0.52%、0.97%、0.65%、0.78%、0.84%、0.61%，表明仪器精密度良好。

2.5重复性实验 取同一批渴乐宁胶囊，按照2.1.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.2项下色谱条件进样检测7种成分的峰面积，计算含量及RSD值，结果7种成分含量的RSD值分别为1.87%、0.85%、1.33%、1.29%、1.71%、1.66%、1.42%，结果表明实验重复性良好。

2.6稳定性实验 按照2.1.2项下方法临用新配供试品溶液，于0、2、6、12、18、24 h进样，统计7种成分的峰面积并计算RSD值。结果7种成分峰面积的RSD值分别为1.10%、0.57%、1.02%、0.69%、0.82%、0.91%、0.59%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7回收率实验 精密称取含量已知的渴乐宁胶囊内容物细粉9份，每份0.5 g，分别精密加入混合对照品溶液(7种成分质量浓度分别为0.031、0.342、0.119、0.178、0.161、0.085、0.294 mg·mL-1)1.0、2.0、3.0 mL各3份，再按照2.1.2项下方法处理，按照2.2项下色谱条件进样检测7种成分峰面积并计算含量，得7种成分的平均回收率及RSD值，见表2。

表2 渴乐宁胶囊中7种成分的回收率实验结果 (n=9)

2.8样品含量测定 取10批渴乐宁胶囊，每批平行3份，按照2.1.2项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下色谱条件进样检测7种成分的峰面积，计算含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果

2.9聚类分析 采用SPSS 26.0软件对10批渴乐宁胶囊进行聚类分析，见图2。由图2可知，10批样品聚为3类，样品S7、S10、S9和S8聚为第Ⅰ类，样品S1、S4、S2和S3聚为第Ⅱ类，样品S5和S6聚为第Ⅲ类。渴乐宁胶囊中7种成分含量存在一定的批间差异，原药材的产地来源、采收时节等可能为引起含量差异的主要因素。

图2 10批渴乐宁胶囊聚类分析树状图

3 讨论

3.1流动相的选择 本实验在选择流动相时，考虑到目标成分太子参环肽B、梓醇、地黄苷D和益母草苷有紫外末端吸收，而甲醇在低波长的检测条件下存在紫外吸收，故有机相选用乙腈，参考相关文献对比考察了乙腈-水[16-19，21-22]和乙腈-2 mL·L-1磷酸[20]流动相体系。结果显示，以乙腈-水为流动相时，基线漂移严重，影响检测；以乙腈-2 mL·L-1磷酸为流动相时，基线相对平稳，7种成分色谱峰分离度均符合要求，通过进一步对有机相与水相的比例进行优化，最终采用2.2项下的洗脱比例进行梯度洗脱对渴乐宁胶囊中7种成分的含量进行同时检测。

3.2提取条件的选择 在供试品溶液制备方法的选择时，分别选取甲醇[16-18，20]、体积分数为60%的甲醇[19]、体积分数为95%的乙醇[21-22]和体积分数为60%的乙醇[23]对比考察不同提取溶剂对渴乐宁胶囊中7种成分的综合提取率的影响，结果以甲醇为提取溶剂时，7种成分的综合提取率最佳，杂质成分干扰较小。同时结合渴乐宁胶囊生产工艺和相关文献，对超声[8-12]提取时间(30、45、60 min)进行优化，最终采用甲醇超声45 min对供试品进行处理。

本实验采用HPLC法对渴乐宁胶囊中7种成分的含量进行了同时测定，首次建立了渴乐宁胶囊多指标成分质量评价模式，同时采用聚类分析法对定量测定结果进行分析评价。所建立的方法操作便捷、结果准确、重复性好。由表3可知，7种成分含量存在批间差异，尤其地黄苷D、太子参环肽B和益母草苷较为明显，表明建立多指标成分质量控制模式对全面控制该制剂的整体质量尤为重要。聚类分析结果提示，药品生产企业应关注原药材质量控制、完善原药材内控质量标准、降低制剂批间质量差异、确保产品质量和临床疗效的一致性。