基于ITS DNA条形码技术的牛至及其混伪品鉴定研究

卓 维，任风鸣*，刘 艳，卢圣鄂，朱 军

(1. 重庆市药物种植研究所 特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室，重庆 南川 408435；2. 新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830004)

牛至(OriganumvulgareL.)，又名滇香薷，是唇形科(Labiatae)牛至属(Origanum)多年生草本植物，该属约有15～20个种，多分布于地中海至中亚地区等地，中国仅有牛至一种，主要分布在浙江、四川、云南、新疆等地[1]。牛至全草入药，具有抗病毒、抗菌、抗氧化等作用，是一种优良的天然植物抗生素[2-3]。从牛至中提取的牛至精油，抗菌作用显著[4-5]，可提高机体免疫力，促进动物生长，作为抗生素替代品在饲料中广泛使用[6-8]。从2020年7月1日起，我国全面禁止药物源抗生素在饲料中添加(不包括中草药)。牛至作为优良的抗生素替代品，市场需求激增，原料供不应求，导致大量混伪品出现。而不同产地牛至表型差异大[10]，形态相似的植物较多，尤其在干燥加工后，叶片呈卷曲状，花脱落，通过形态学方法难以进行准确鉴定。大量混伪品混迹市场，严重影响牛至产品的安全性和有效性，迫切需要建立快速、有效的鉴定方法。

近年来，国内外对牛至的研究主要集中在牛至油化学成分的提取与分析[10]、活性成分应用[11-12]、动物生产应用和饲料添加剂开发[13]、牛至种下类群研究[14-15]等方面，对牛至属植物基原鉴定的研究较少。牛至属基原鉴定主要是采取性状鉴别和显微鉴定法两种传统方法，宫海燕等[16]首次使用显微法对新疆牛至不同部位的性状及显微特征进行分析。但是，这类方法主观性较强，需要精准的结构图为参考资料，鉴别人员也需专业的知识背景，这使得准确鉴定较为困难。而DNA条形码是基因组中一段高度保守的DNA片段，鉴定方法不受个体形态特征和发育阶段影响、从基因水平上客观区分物种，同时该方法操作步骤简单、稳定性较好，常被用于植物的快速识别与鉴定[17]。余春霞等[18]研究巴西牛至属植物药HORTELA时，发现性状鉴别和显微特征均不能准确鉴定其基原，而通过DNA条形码能确定其基原植物。本试验采用ITS DNA条形码技术，通过BLAST比对、K2P遗传距离、SNP分析以及NJ树4种方法评估其鉴定效率，以期寻找牛至快速、精准的分子鉴定方法，为牛至的安全、有效利用提供依据和支撑。

1 材 料

1.1 植物材料

本研究涉及74份研究对象，包括牛至属(Origanum)9个种、薄荷属(Mentha)2个种、香薷属(Elsholtzia)3个种、石荠苎属(Mosla)1个种，并选择荆芥(Nepetahormozganica)和益母草(Leonurusjaponicus)为外类群。采集的植物样本来源于云南大理、昆明、丽江及重庆云阳、长寿、渝北等地，经重庆市药物种植研究所刘正宇研究员鉴定后，取新鲜叶片硅胶干燥保存备用，样品信息见表1。

表1 样品信息Table 1 Experimental sample information

表1 样品信息Table 1 Experimental sample information

1.2 试剂

植物基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)购自北京君诺德生物技术有限公司；PCR扩增使用的I-5TM2×High-Fidelity Master Mix购自北京擎科生物科技有限公司；DL 2000 DNA maker购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；ITS引物合成由擎科生物科技有限公司完成；其他实验试剂均为国产分析纯试剂。

2 方 法

2.1 植物DNA提取

参照植物基因组DNA快速提取试剂盒说明书，选择干燥后的植物叶片用球磨仪以1 800次/min研磨2 min，称取样品细粉20 mg，按照说明书提取样品基因组DNA，电泳检测条带，分光光度计测定纯度和质量后置于-20℃备用。

2.2 PCR扩增与测序

试验反应体系为25 μL，包括正反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，2×High-Fidelity Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.8 μL，模板DNA 2 μL。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30s，53℃退火30 s，72℃延伸40 s，38个循环。ITS引物(F：5'-CCTTATCATTTAGAGGAAGG-3'，R：5'-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3')，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京擎科生物有限公司测序。

2.3 数据分析

测序结果用Bod Edit和DNAMAN软件对序列进行编辑和拼接；使用软件ClustalX和MEGA 7.0.14对齐序列，分析样本序列特征，碱基变异位点，并使用MEGA软件中K2P双参数模型计算遗传距离。将获得的完整序列建立NJ系统进化树，设置bootstrap值为1 000。用相似性搜索BLAST法于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库对序列进行比对。

3 结果与分析

3.1 ITS序列特征

本试验采集的牛至及其混伪品样品经PCR扩增ITS序列，电泳凝胶成像检测后在500～750 bp中间呈现单一且明亮条带，扩增成功率为100%。纯化回收送至公司测序，测序成功率均为100%。分析74条ITS序列的特征(表2)，发现序列长度为631～661 bp，碱基C+G含量在55.3%～65.6%；其中牛至ITS序列长度为646～659 bp，碱基C+G含量在58.1%～58.7%。

表2 样本ITS序列特征Table 2 Sample ITS sequence characteristics

不同属植物的种内变异位点存在差异，其中牛至(O.vulgare)、留兰香(M.spicata)、球花香薷(E.strobilifera)以及荆芥草(N.hormozganica)的种内变异位点较多，分别含有8个、8个、11个和22个变异位点；而O.boissieri、O.sipyleum、石香薷(M.chinensis)和百里香(T.mongolicus)无变异位点。

3.2 BLAST法比对序列

将获得的30份牛至及其混伪品样品ITS序列上传数据库获得ID号，并通过BLAST法于NCBI数据库比对序列，选择相似度最高的物种，比对结果显示(表3)：牛至、薄荷、野香草、香薷、球花香薷和石香薷均鉴定成功，最高相似度序列均为对应物种，而留兰香最高相似序列为Menthacanadensis(KC473228.1)有98.62%，其次为Menthaspicata(DQ667244.1)有98.47%，但其相似物种均为薄荷属植物，未有牛至属植物，即通过BLAST法能够成功鉴定牛至样品。

表3 试供样品在NCBI中BLAST鉴定结果Table 3 BLAST identification results of test samples in NCBI

3.3 遗传距离分析

基于K2P遗传距离模型计算ITS序列的种间、种内遗传距离(表4)。试验样品ITS序列的种内平均遗传距离为0.002(0～0.008)，种间平均遗传距离为0.125(0.008～0.239)，样品的种间最小遗传距离均大于种内最大遗传距离。故通过遗传距离分析能够成功鉴定牛至及其混伪品。

表4 试验样品ITS序列的遗传距离Table 4 The genetic distance of the ITS sequence of the test sample

“Barcoding gap”是指理想DNA条形码中种内遗传距离明显小于种间距离，两者之间存在明显的界限。K2P遗传距离模型中样品ITS序列的种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的56.82倍，遗传距离分布图具有明显的“Barcoding gap”，未有样品重叠(图1)，故ITS序列可作为牛至及其混伪品的DNA条形码。

图1 牛至及其混伪品ITS序列的遗传距离分布图Fig. 1 The barcoding map of ITS sequences in O.vulgare and its adulterants

3.4 SNP位点分析

利用MEGA软件比较74条ITS序列变异位点，寻找特异性SNP，结果表明(图2A)：牛至属内存在2个稳定的变异位点，第36位碱基均为T，第535位碱基均为A，明显区别于混伪品，但牛至无特异性SNP，故不能通过SNP位点鉴定牛至及其混伪品。

同时，发现牛至属不同种ITS序列中共存在21个变异位点(图2B)，除牛至无特异性SNP位点，其他8个种均有SNP位点。其中，O.grosii、O.dictamnu、O.onites有1个SNP位点，O.elongatum、O.majorana、O.boissieri有2个SNPs位点，O.syriacum有3个SNPs位点，O.sipyleum有9个SNPs位点。

图2 SNP位点分析Fig. 2 SNP locus analysis注：A图为样品的SNP位点分析，B图为牛至属下9个种的SNP位点分析。

3.5 系统进化树分析

基于74条ITS序列构建牛至及其混伪品NJ系统发育树，聚类结果如图所示(图3)：牛至属植物聚为一大支，自展支持率为99%，牛至、O.grosii、O.elongatum、O.majorana等9个种分别单独聚为一支，聚集度较好，具有良好的单系性；而混伪品百里香、薄荷、留兰香、野香草、香薷、球花香薷、石香薷分别单独聚为一支，未出现与牛至交叉现象，自展支持率均大于50%；外类群益母草和荆芥草位于进化树外围，单独聚为一支。在NJ树中，牛至与百里香、薄荷、香薷等7种混伪品聚于不同分支，故NJ树能够有效鉴定牛至及其混伪品。

图3 基于ITS序列构建NJ聚类树Fig. 3 Constructing clustering Neighbor-Joining tree based on ITS sequence

4 讨 论

我国农业部已经批准牛至油作为一种药物饲料添加剂可长期在饲料中使用，欧盟食品安全局亦评估牛至精油为安全的动物饲料添加剂[19]。随着全面饲料“禁抗”政策实行，牛至作为天然植物“抗生素”，具有广阔的市场发展和应用前景[20]。但随着牛至原料需求量增加，市场上出现大量混伪品，薄荷、香薷、百里香等植物常被混为牛至使用。因此，本研究基于ITS序列对牛至及混伪品进行分子鉴定，发现BLAST法、K2P遗传距离法、NJ树可成功鉴定牛至及其混伪品，鉴定效率为100%；而SNP分析不能成功鉴定牛至。BLAST法中牛至样品相似度最高的序列为99.85%(Origanumvulgare, MH645777.1)，且无其他物种混杂；遗传距离分析显示样品的种间最小遗传距离均大于种内最大遗传距离，存在明显“Barcoding gap”；NJ进化树中牛至样品聚为一支，呈单系群，同一种植物聚类明显无交叉，故ITS序列可作为牛至鉴定的DNA条形码。

遗传多样性是指不同种群之间或一个种群内不同个体的遗传变异，种内的遗传变异程度决定其种群进化的趋势[21]。目前，关于牛至属遗传多样性方面的研究主要集中在国外，Kaoutar等[22]使用微卫星基因座将摩洛哥OriganumcompactumL.分为3大种群，种群之间高度分化(Fst = 0.22)，基因流率低(Nm = 0.88)，推测是由于生境干扰而导致的种群隔离。El-Shaimaa等[23]使用AFLP法发现牛至属植物具有丰富的多态性信息。而Karagoz等[24]通过iPBS标记将土耳其牛至(Origanumacutidens)分为3个主群8个亚群，群体间遗传分化小(Fst = 0.22)，杂合度为0.354。本研究采集了云南昆明、大理、丽江三个地区的牛至样品，其种内平均遗传距离为0.002，NJ树中三个地区的牛至样品相互交叉聚为一大支，表明云南地区的牛至群体间遗传分化小，亲缘关系近，未呈现因地理距离导致的种群分化。结合前人对不同地域牛至属植物遗传多样性的研究[21-24]，发现不同地域的牛至属种群遗传多样性呈现不同的分化模式，这可能是因为地理环境影响导致种群隔离，基因交流频率低，亲缘关系逐渐变远，形成种内高度分化[25]，也可能与牛至繁育方式(花粉、种子)，自然环境相关，导致呈现不规律的遗传分化。

单核苷酸多态性SNP分子标记具有数量多、分布广、遗传稳定等特点，是目前最具发展潜力的分子标记[26]。该技术已成功应用于中药材及其混伪品的鉴定，包括三七[27]、柴胡[28]、人参[29]、黄芪[30]等常用药材的分类与鉴定。除此之外，SNP分子标记也用于同属多种(亚种)植物的分类与亲缘关系分析。兰青阔等[31]研究贝母属种下分类与川贝母中药资源鉴定时发现，川贝母、浙贝母等的叶绿体基因组序列上均有独特的SNP鉴定位点。卢媛等[32]利用SNP标记芯片技术对49份不同来源的糯玉米和普通玉米自交系进行全基因组扫描，旨在将谱来源不清晰的玉米品种明确归类。本研究中，发现牛至属O.grosii、O.elongatum、O.syriacum等8个种均有独特的变异位点，通过这些SNP 位点可成功区分牛至属8个种，这为牛至属下分类与鉴定提供参考依据，该变异位点亦是潜在分子标记。本研究利用DNA条形码技术，通过ITS序列成功鉴定牛至及其混伪品，找到牛至属种内鉴定与分类的潜在SNP分子标记，这不仅为正确区分牛至、减小市场上混淆品使用，规范、安全合理地利用牛至资源提供理论支持，而且为牛至种质资源评价、遗传多样性研究和丰富牛至属DNA条形码数据库提供帮助。