基于网络药理学探讨红芪的活性成分、作用靶点及潜在治疗价值

张 锐，顾志荣，吕 鑫，葛 斌

(1. 甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000；2. 甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000)

红芪是豆科植物多序岩黄芪的干燥根，功能补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌[1]。红芪主要分布在甘肃的六盘山及南部山地处，与黄芪同科异属，首载于《神农本草经》中黄芪项下，同被列为上品。红芪与黄芪的功效大致相同，但在物质基础、药理药效方面存在一定差异[2]。红芪以其复杂的化学成分、多重的药理作用及巨大的治疗价值受到广泛关注。研究表明，红芪的主要化学成分有皂苷类、黄酮类、苯丙素类、糖苷类、多糖、氨基酸、微量元素等，具有抗氧化[3]、促生长[4]、调节免疫[5]、抗肿瘤[6]、抗炎[7]、神经保护[8]、抗老年痴呆[9]、保护心肌[10]、抗骨质疏松[11]、抗贫血[12]、抗衰老[13]等广泛的药理作用，其中抗肿瘤、治疗糖尿病并发症、抗骨质疏松及化学成分与药理作用的“谱-效”关系等是目前研究的热点。

网络药理学是近年来随着“互联网+大数据”的快速发展而兴起的交叉学科，它通过系统、综合的思路探讨“药物-靶点-疾病”之间的深层次、全面的作用机制，与中医药的整体性、系统性思维完全契合，是近年来快速发展的研究中医药复杂作用的有力工具[14]。红芪的活性成分种类较多且复杂，药理作用较为广泛，开发利用价值较大，在多种疾病治疗中显示了很大的潜力，因此有必要基于网络药理学技术对其活性成分、作用靶点及潜在的治疗价值进行深入梳理与探讨，为其进一步研究提供有益思路。

1 资料与方法

1.1 分析软件和数据库

中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库(http://lsp. nwu. edu. cn/tcmsp. php)，UniProt蛋白数据库(http://www. uniprot. org)，Swiss Target Prediction服务器(http://www. swisstargetprediction. ch/)，String数据库(https://string-db. org/Version 10.5)，Cytoscape 3.6.0软件，David数据库(https://david. ncifcrf. gov/home. Jsp)。

1.2 活性成分的筛选

TCMSP[15]采用的是HIT数据库预测算法SysDT来获得药物靶点之间的关系，在TCMSP中可获取每种药物的药代动力学信息，如类药性(Drug like，DL)、口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)、血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)、肠上皮通透性(Intestinal epithelial cells，Caco-2)、脂水分配系数(Lipid-water partition coefficient，ALogP)、H键供体/受体(H bond donor/acceptor，H don/H acc)等。OB指药物被吸收进入人体循环的速度与程度，DL指化合物与已知药物的相似性。通过操作TCMSP收集、整理红芪中的所有化学成分，并依据OB≥30%且DL≥0.18筛选出红芪中的活性成分。

1.3 候选化合物靶点的预测

Uniprot(Universal protein resource，UniProt)数据库被认为是收录最广泛和注释信息最全面的蛋白质数据库，其数据主要来自于基因组测序项目完成后，后续获得的蛋白质序列。通过Uniprot数据库将TCMSP挑选出的目标蛋白名转化为基因名，并找出其对应的Uniprot ID，最后汇总整理。

1.4 靶点蛋白的补充

从TCMSP的候选化合物的“Pubchem Cid”中进入，在Swiss Target Prediction中利用SMILES格式预测靶点蛋白，将其与“1.3”项所得基因汇总在一起，进行收集整理。

1.5 网络的构建与分析

将“1.4”项得到的基因名进行查重，得到潜在靶点，将其导入String网站中，得到红芪中的“活性成分-靶点”网络模型图，将其以TSV格式通过Excel导出后，带入Cytoscape 3.6.0软件中，利用Network Analyzer插件进行网络分析，绘制网络图。将Betweenness Centrality(介数中心性值，接近中心性高的靶标与更多的靶标直接相连，表明该靶标在不同疾病病机过程中的重要性)和Degree(结点中心度，反映与某个靶标共同参与不同疾病病理过程的其他靶标数目)中的数据选取高于平均值以上，并将其对应的基因摘出，找出相应的Uniprot ID，便得到关键靶点。

1.6 靶标的GO富集分析及KEGG通路分析

将从“1.5”项中得到的关键靶点Uniprot ID导入David数据库功能注释工具中进行分析。进入Functional Annotation Chart，下载“Gene Ontology”中的生物过程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)和细胞组成(Cellular component，CC)，进行GO富集分析，并下载“Pathways”中的KEGG_PATHWAYS进行KEGG通路分析。

1.7 目标疾病的预测

将关键靶点的Uniprot ID导入David数据库功能注释工具中，操作进入Annotation Summary Results界面后，同时操作“Disease”中的GAD_DISEASE和OMIM_DISEASE，然后进入Functional Annotation Chart。将数据下载后导入Excel中，再根据其P值选择对应的疾病，即为其预测的疾病。

2 结 果

2.1 活性化合物的筛选

在TCMSP数据库中，以中药“红芪”为“Herb name”搜索红芪中的所有化学成分，共得到43个化学成分。结合阈值(OB≥30%且DL≥0.18)筛选后，共得到14个活性成分。结果见表1。

表1 红芪中14个活性化合物的基本信息Table 1 Basic information of 14 active compounds in Radix Hedysari

2.2 活性成分-靶点相互作用的网络分析

从TCMSP数据库整理得到的有关红芪的靶点基因共有405个，将红芪的Smiles格式上传到Swiss Target Prediction网站，共得到278个潜在作用靶点。对汇总的靶点基因进行查重后，共得到334个靶点基因。利用String网站对查重后的潜在靶点进行网络分析，得到红芪的“活性成分-靶点”网络模型图(图1)。分析其网络模型图，发现有303个节点，1227条边。网络中的节点表示红芪中的药物活性成分与关键靶点基因；网络中的边表示单味药与活性成分及活性成分与关键靶点基因。

图1 红芪活性化合物-靶点网络图Fig. 1 Network diagram of active compounds - targets of Radix Hedysari

选取Betweenness Centrality、Degree均大于其平均值的57个靶标作为关键靶标，如表2所示。其中，Degree值在前5名的靶点基因分别为AKT1、TP53、IL6、VEGFA及MAPK3，表明这些基因在网络中具有重要的位置，可作为红芪有效成分作用的靶点基因。

表2 红芪的57个关键靶标Table 2 The 57 key targets of Radix Hedysari

续表2 红芪的57个关键靶标Table 2 The 57 key targets of Radix Hedysari

2.3 GO富集分析

利用DAVID数据库对关键靶标进行GO分析，包括生物过程、细胞组成和分子功能分析，结果如表3～5所示。GOBP分析显示有462条生物学过程与此有关，最显著的5条分别为RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的阳性调控、对药物的反应、转录的阳性调节，DNA模板、凋亡过程的负调节及信号传导。GOCC分析显示有48条细胞组成与此有关，最显著的5条分别为细胞核、胞质溶胶、细胞质、核质及质膜。GOMF分析显示有73条分子功能与此有关，最显著的5条分别为蛋白质结合、酶结合、相同的蛋白质结合、转录因子结合及DNA结合。结果表明，红芪可以通过参与调控多种生物学过程而发挥其治疗作用。

表3 GO-BP分析结果Table 3 Analysis results of GO-BP

表4 GO-CC分析结果Table 4 Analysis results of GO-CC

2.4 KEGG通路分析

采用Omicshare数据库中的高级气泡图技术对KEGG进行通路分析，其中前20条通路结果如图2。富集最显著的5条通路为癌症的途径(Pathways in cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、癌症中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)及肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)。在与疾病类相关的通路中，主要有乙型肝炎(Hepatitis B)、癌症的途径(Pathways in cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、恰加斯病(美国锥虫病)(Chagas disease (American trypanosomiasis)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)及利什曼病(Leishmaniasis)等；与信号传导功能相关的有肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、雌激素信号通路(Estrogen signaling pathway)、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)及催乳素信号通路(Prolactin signaling pathway)等。

图2 红芪作用核心靶点的KEGG富集分析Fig. 2 KEGG enrichment analysis of the core target of Radix Hedysari

2.5 治疗疾病的富集分析

在DAVID网站对红芪作用的关键靶点进行疾病富集分析，有显著性差异的潜在的治疗疾病结果如表6。可知，红芪具有潜在治疗价值的疾病主要是膀胱癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌等癌症，以及慢性阻塞性肺疾病和慢性肾功能衰竭，其中P值最小值所对应的疾病为膀胱癌。

表6 红芪治疗的疾病富集分析Table 6 Enrichment analysis of RadixHedysari in the treatment of diseases

3 讨 论

本研究通过网络药理学相关技术，从红芪药物中筛选出了14个活性成分和683个靶点基因，通过对这些靶点基因进行网络分析，发现度值比较高的靶点基因有AKT1、TP53、IL6、VEGFA、MAPK3等。治疗疾病的富集分析表明，红芪具有潜在治疗价值的疾病主要是膀胱癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌等癌症。已有研究发现，AKT1在肿瘤化疗的耐药性方面有着极其重要的作用，AKT1可调控胃癌细胞对阿霉素的耐药性，且经常与NF-kappaB、Notch-1、PTEN等共同发挥作用[16]。TP53基因与肿瘤的关系极其密切，可通过缺失、突变等直接影响p53蛋白的活性，进而导致许多肿瘤的发生[17]。其中，TP53INP1在肝癌组织和癌旁正常肝组织中都有表达，但TP53INP1在癌旁正常肝组织中比肝癌组织中表达更加强烈，可推测TP53INP1具有一定效果的抑癌作用[18]。IL6的缺失会加速肝癌、结直肠癌的发生，增加脏器中的肿瘤负荷，因此可推测IL6基因能够抑制肿瘤的生长[19]。VEGFA(血管内皮生长因子A)在肝细胞癌中的表达率很高，它是VEGF的6个亚型中最重要的一个，主要影响血管内皮细胞的增殖和分化[20]。而肝癌组织中分布着极丰富的血管，因此VEGFA对肝癌的治疗具有良好的作用。VEGFA与miR-206存在直接的靶向关系，miR-206过表达靶向VEGFA对人肝癌HepG2细胞的侵袭和迁移具有明显的抑制作用[21]；而miR-205也可以借助VEGFA来控制乳腺癌的增殖[22]。

本研究发现，红芪作用的潜在通路有癌症的途径、膀胱癌、癌症中的蛋白多糖、乙型肝炎、肿瘤坏死因子信号通路及HIF-1信号通路等91个。其中，癌症的途径参与多种活性化合物的抗癌机制，如PI3K/AKT途径参与卵巢癌[23]、乳腺癌[24]、非小细胞肺癌[25]、结直肠癌[26]等，Wnt途径参与前列腺癌[27]、结肠癌[28]、乳腺癌[29]、肝癌[30]等。MAPK signaling pathway与肿瘤恶性演进密切相关，MAPK及其信号通路在肿瘤侵袭和转移中起到中介和信号放大作用，能够接受大量来自生长因子、丝裂原、环境刺激等的信号，还可通过MAPK级联反应作用于核转录因子，调控基因表达[31]。如p38 MAPK信号通路的激活，能够增强宫颈癌细胞的细胞毒性T淋巴细胞反应[32]；抑制MAPK信号通路，能够克服他莫昔芬耐药性并改善乳腺癌的预后；通过抑制MAPK信号通路能够抑制BRAF突变型结肠癌细胞的生长[33]。

本研究发现，β-谷甾醇、槲皮素也是红芪的主要活性成分，而这2个成分在已有的红芪相关研究中并未得到足够的重视。β-谷甾醇具有较好的抗氧化、抗菌、抗癫痫等作用，并对胃癌、肝癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌等各种癌细胞均有较好的抑制作用，其中对胃癌的作用尤强[34]。槲皮素对宫颈癌HeLa细胞的增殖有明显的抑制作用，也可诱导HeLa细胞发生自噬，而其机制与抑制TGF-β signaling pathway有关[35]；能够抑制人转移性卵巢癌细胞的生长并调节PA-1细胞系固有凋亡途径的相关成分[36]；通过PI3K/AKT通路促进人胰腺癌细胞的死亡，并增强其化学敏感性[37]；对结肠癌LOVO细胞的增殖侵袭能力具有抑制作用，并能抑制癌胚抗原(CEA)的表达[38]；通过抑制VEGF/PI3K/Akt信号通路，联合二甲双胍能够协同抑制前列腺癌细胞[39]。