多花黄精内生真菌多样性研究

程子洋，黄宇飞，邬家成，孙 涛，王国凯

(1.黄山学院 化学化工学院，安徽 黄山245041；2.安徽中医药大学 中药研究与开发安徽省重点实验室，安徽 合肥230012；3.安徽中医药大学 医药信息工程学院，安徽 合肥230012)

多花黄精（Polygonatum cyrtonemaHua.）是百合科多花黄精属植物[1]，为“十大皖药”之一，是我国传统中药，最早由《名医别录》记载，也是2020年版《中国药典》收载的3种黄精之一，常以干燥根茎入药。多花黄精根状茎肥厚，通常连珠状或结节成块，广泛分布在江西、湖南等地区[2]，大多生长于灌木丛、山林或者山坡背阴处。药理研究表明多花黄精具有延缓衰老、养阴生津、抗骨质疏松、抗疲劳、抗癌、抗糖、调节免疫力、神经保护作用等[3,4]，其营养价值也十分丰富[5]，在药膳、保健品、化妆品、食品和饲料添加剂等方面都具有很高的开发价值,市场前景广阔[6,7]。多花黄精中富含皂苷、黄酮、蒽醌、多糖、木质素等化合物[8,9]，具有良好的药用价值。

植物内生真菌是寄生于健康植物，并不使寄主表现任何疾病症状的一类真菌[10]。植物与内生真菌形成良好的生态共生关系，内生真菌可以从植物中吸取自己所需的营养物质，也在促进植物正常的生长发育进化过程中起到重要的作用，比如内生真菌的代谢物可以刺激植物的生长发育，帮助植物抵御自然病虫害的侵袭，也能够增强宿主植物的抗旱能力、毒性、减少动物的伤害，从而形成两者之间的共生互作。近些年对内生真菌的研究方向主要集中在次生代谢产物方面，在药物植物中的内生真菌大部分存在药理活性物质，例如抗氧化、抑制肿瘤生长等。同时，药物植物内生真菌是发现活性化合物以及新药源的潜在资源[11,12]。内生真菌是植物微生态系统天然的组成部分，对植物有多方面的积极作用。因植物内生菌有充分的碳源和氮源供应，相对于暴露在外界的恶劣环境更有利于发挥生物防治作用[13]。目前，国内外对多花黄精的研究报道较少，李艳玲等[14]研究了泰山黄精内生真菌的分布及其多样性，并筛选具有抑菌活性的内生真菌。黄银芳等[15]对多花黄精不同组织部位内生真菌进行分离并进行抗菌活性筛选。曹冠华等[16]调查不同产地滇黄精根系中丛枝菌根真菌和深色有隔内生真菌定殖情况，并探讨其与主要功效成分之间的相关性。本研究从多花黄精中分离出多种内生真菌，丰富了多花黄精内生真菌的资源，以期为多花黄精的综合开发利用提供依据。

1 实验部分

1.1 实验原料

多花黄精（Polygonatum cyrtonemaHua.）2019年7月采自安徽省黄山市休宁县商山镇，经安徽中医药大学谢冬梅副教授鉴定。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）不含抗生素，北京奥博星生物技术有限责任公司提供。

1.2 实验仪器

SPT-P250C智能生化培养箱（合肥华德利）；SW-CJ-2FD双人单面超净工作台（苏州苏洁）；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安）；TGL-16G台式离心机（上海安亭）；植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒（天根生化）；G-BOX凝胶成像系统（Syngene公司）；DYY-8C电泳仪（北京六一）。

2 实验方法

2.1 内生真菌的分离、纯化

采用组织块分离法。取多花黄精新鲜健康植株根部，去须根，蒸馏水冲洗，滤纸吸干水分，放置阴凉处风干。在超净工作台依次进行以下消毒步骤：75%乙醇浸泡2min，5%次氯酸钠冲洗3min，75%乙醇冲洗30s，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分。吸取200μL最后一次冲洗的无菌水，用无菌涂布棒均匀涂布在PDA表面，作为空白对照，平行3份。取经过处理的多花黄精，无菌滤纸充分吸干水分，切成0.2×0.2cm小块。将组织块接种于PDA培养基中，每个培养基中4块，28℃恒温培养箱中培养7-14d。采用尖端菌丝挑取法挑取不同形态的菌丝，移至新PDA培养基中纯化，纯化培养2-4代后，将内生真菌转移到PDA斜面培养基，保存备用。

2.2 内生真菌的形态鉴定

将内生真菌置于PDA培养基28℃恒温培养箱中培养5-10d，观察真菌菌落大小、菌丝形态、表面特征、产孢结构类型及孢子形态等，参照《真菌鉴定手册》[17]进行初步鉴定。

2.3 分子鉴定

挑取适量单一菌丝体，置酒精燃烧消毒并冷却后的研钵中。加入液氮3次冷冻菌丝体，充分研磨后，按照基因组DNA小量提取试剂盒操作步骤，得到DNA提取液。然后将DNA溶液置于-20℃冰箱中保存备用。采用扩增真菌引物对ITS1/ITS4进行PCR扩增，序列：ITS15′-TCCGTAGGTGAACCTGC⁃GG-3′，ITS45′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，50μL体系进行PCR扩增，如表1。

表1 PCR扩增rDNA-ITS的反应体系

测序结果在GenBank数据库中进行同源性比对。利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库BLAST中已知序列对其进行相似性分析与鉴定，得到真菌的分类并构建系统发育树。

2.4 分离频率

分离频率[18]（isolation frequency，IF）=分离到的各属内生真菌的菌株数÷内生真菌分离菌株总数×100%。当IF>10%时，定义为优势属，当5%

3 结果

3.1 内生真菌的分离

通过组织块分离法，从多花黄精中分离得到70株内生真菌，分属于21属59种。其中Diaporthe5株，Fusarium23株，Arthrinium1株，Phomopsis2株，Rhizopus2株，Aspergillus5株，Talaromyces4株，Peni⁃cillium5株，Cladosporium1株，Alternaria5株，Clonos⁃tachys2株，Colletotrichum3株，Macrophomina1株，Sordariomycetes1株，Neurospora1株，Gliocladiopsis3株，Setophoma1株，Ascomycete1株，Kohlmeyeriop⁃sis1株，Trichoderma2株，Gibberella1株。

3.2 形态学的鉴定

分离得到的内生真菌通过菌落对比和显微观察，HJ1、HJ14、HJ52、HJ73、HJ78子囊果壁亚革质，内部灰色，有长喙，子囊梭形，子囊孢子梭形至椭圆形，无色。HJ4、HJ44、HJ49、HJ66、HJ70表面菌丝呈棉絮状，较密集，分生孢子梗单生或集成分生孢子座，或产生轮辐状排列的瓶型小梗，大型孢子微弯或两端尖而弯曲显著，镰刀型，小型孢子长圆形，直或微弯。HJ16、HJ53菌丝在基质面跳跃式蔓延，并在与基质接触点产生黑褐色假根深入基质，孢囊梗由假根处的匍匐菌丝生出，孢子囊先呈白色，后变为青黑色，表面有针形结晶，容易消融。囊轴与囊壁基部相结合，在囊壁消失后与中轴基连城棍棒形。HJ42分生孢子梗簇生，颜色较暗，从生成为黑点，形状和大小变化较大，呈卵圆形或圆筒形。在培养过程中生长度极慢。HJ27、HJ37、HJ39、HJ41、HJ43菌落生成大量小颗粒状孢子团，产生绿色或黑色孢子粉，分生孢子梗垂直生出，多无隔膜，顶端膨大成椭圆形、半圆形、球形或棍棒形的泡囊。HJ31、HJ56、HJ58、HJ79小梗细长，分生孢子椭圆形，两端尖，光滑，带暗蓝绿色至灰绿色。HJ32、HJ55、HJ57、HJ62、HJ87菌落绿色、黄绿色、青绿或灰绿色，分生孢子串呈不分枝链状，球形、卵圆形、椭圆形的单个孢子，光滑或粗糙，无色、绿色或其他杂色。HJ50、HJ51、HJ54、HJ64、HJ74分生孢子暗色，有纵横隔膜，倒棍棒形，椭圆形或卵形，形成链，顶端有喙状的附属丝。HJ23、HJ60、HJ77分生孢子盘先埋葬后暴露，深色，分生孢子梗短，不分枝，分生孢子圆筒形至纺锤形。HJ16、HJ53孢子囊先呈白色，后变为青黑色，半球形或球形，表面平滑或有针形结晶，容易消融。HJ63分生孢子较为狭长，分生孢子椭圆形至棍棒形，微弯，菌核呈黑色。HJ65子囊壳表生，壁膜质或革质，有少量的毛，略透明，有孔口，口内有周丝，子囊圆筒形，子囊之间有侧丝，一般为胶质膜所包围。HJ72子囊壳有毛，壁亚革质或炭质，顶部突起处生孔口，子囊圆筒形。HJ85表面菌丝发达，有隔膜，可直接产生孢子或孢子梗，或集结成为菌核或子座，分生孢子大都外生，暴露于外或分生孢子器中。HJ59、HJ76菌落呈白色，分生孢子密生于小梗的顶端，螺旋形排成簇状。HJ82、HJ83、HJ88分生孢子光滑，在培养基上初为无色，后转灰褐色，背部暗褐色至黑褐色，厚桓孢子结集成不规则的球形。HJ94、HJ97菌落菌丛密集，菌丝侧枝分生出孢子梗，直立，分枝，小枝常对生，顶端不膨大，上生分生孢子团，分生孢子球形，浅色或无色。HJ94、HJ97菌落初期为白色，渐变为粉色或紫色，生长迅速，分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，直立，分枝，小枝常对生，顶端不膨大，上生分生孢子团。菌株HJ71因不产生孢子，因此形态学和显微鉴定无意义。参考《真菌鉴定手册》，鉴定菌株HJ1、HJ14、HJ52、HJ73、HJ78为腐皮壳属（Diaporthe）；HJ4、HJ44、HJ49、HJ66、HJ70为镰孢霉属（Fusarium）；HJ27、HJ37、HJ39、HJ41、HJ43为曲霉属（Aspergillus）；HJ31、HJ56、HJ58、HJ79为黄丝曲霉属（Talaromyces）；HJ32、HJ55、HJ57、HJ62、HJ87为青霉属（Penicilli⁃um）；HJ50、HJ51、HJ54、HJ64、HJ74为交链孢霉属（Alternaria）；HJ23、HJ60、HJ77为刺盘孢菌属（Colle⁃totrichum）；HJ16、HJ53为根霉属（Rhizopus）；HJ85为子囊菌属（Ascomycete）；HJ94、HJ97为木霉属（Trichoderma）；HJ98为赤霉属（Gibberella）。形态与显微形态特征如图1所示。

图1 内生真菌菌落及显微结构

3.3 分子生物学鉴定

3.3.1 PCR扩增产物电泳

PCR扩增后，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，在550bp左右处可见单一明亮的条带。

3.3.2 对比rDNA-ITS序列、构建系统发育树

对比美国国家生物技术信息中心国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology In⁃formation，NCBI)（www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库已知序列，结果见表2。利用MEGA4.0和ClustalX软件构建rDNA-ITS分子序列系统发育树，如图2所示。

图2 邻接法构建内生真菌ITS序列系统发育树

表2 多花黄精内生真菌分子鉴定序列比对表

续表2

由上可知多花黄精内生真菌分布类型广泛，分布的21个属主要集中在Fusarium、Diaporthe、Asper⁃gillus、Penicillium和Alternaria中，占比61.43%。分布最广的Fusarium属共有23株，其分离频率为32.86%，是多花黄精的优势种群。

4 讨论

内生真菌几乎在所有的植物体内均有分布[19]。在植物微生态系统中，药用植物内生真菌是其重要组成部分，有的内生真菌影响植物的萌发以及生长发育，有的内生真菌具有合成宿主次生代谢产物的能力[20]。近年来，随着对药用植物分类、化学、药理等方面的深入研究，有关药用植物内生真菌备受关注。随着市场需求量的增加，多花黄精逐渐成为一种具有广泛发展前景的药食同源中药[21]。查阅文献发现，关于多花黄精内生真菌研究的相关报道较少，本研究通过对多花黄精内生真菌的培养、分离、鉴定，共分离得到70株菌种。结果显示，在多花黄精中分布最广的是镰孢霉属（Fusarium），共有14种23株，其SF值为32.86%，为多花黄精的优势种属。镰孢霉属是自然界中广泛存在的一种微生物类群，在宁前胡、霍山石斛[22]、海南粗榧[23]、亳芍[24]等植物中也广泛存在。本实验中分离得到的部分菌株在其他黄精中已有发现，如Fusarium、Diaporthe、Aspergil⁃lus、Penicillium和Alternaria等，也是上述多花黄精中分离频率较高的菌种，其他属内生真菌如Clonos⁃tachys、Macrophomina、Sordariomycetes、Neurospora、Gliocladiopsis等还没有在相关多花黄精内生真菌文献中报道过，本研究对多花黄精药用部位内生真菌进行初步研究，丰富了内生真菌的种类和资源，为多花黄精的开发利用和资源保护奠定基础。