复幼方药味配伍对盐知母中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷提取率及稳定性的影响

庞琳诺，倪健，蔡梦如，马葆睿，张志勤，白杰，张萌，王晓玲*，曲昌海*（.北京中医药大学中药学院，北京 0488；.首都医科大学附属北京儿童医院，北京 00045）

知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根茎，味苦、甘，性寒，归肺、胃、肾经，有清热泻火、滋阴润燥之功[1-2]。新芒果苷、芒果苷、异芒果苷为知母药材中具有代表性的双苯吡酮类成分[3]，结构如图1所示。现代药理研究表明，此类成分具有抗炎、降血压、抗糖尿病等多种药理作用[4-6]，知母饮片盐炙后芒果苷含量显著升高[7]、新芒果苷和异芒果苷含量降低[8]，且盐炙后能够促进新芒果苷在大鼠体内的吸收[9]。

图1 芒果苷、异芒果苷及新芒果苷化学结构式Fig 1 Chemical structures of mangiferin，isomangiferin，and neomangiferin

复幼方为首都医科大学附属北京儿童医院的临床经验方，盐知母为方中君药，全方由盐知母、生地黄、玄参、醋鳖甲、关黄柏等11味中药组合而成，盐知母具有滋补肝肾、清热泻火的作用，用于治疗女童性早熟疗效确切[10]。原剂型为合剂，携带、贮存不便且口感不佳，本课题组拟将复幼方开发成质量稳定、疗效确切的颗粒剂，以君药盐知母中的芒果苷作为质量控制的指标性成分之一，在复方工艺研究过程中发现，芒果苷在提取和干燥过程中，含量损失较大，80℃下减压干燥，芒果苷损失率约48%。而在同样条件下对盐知母进行单独提取，芒果苷的含量却并未发生明显变化。

作者在前期研究中还发现，在相同提取条件下，新芒果苷、芒果苷、异芒果苷在单体溶液及盐知母水提液中稳定性良好，在复幼方水提液中3种成分含量发生改变，由此猜测复幼方中的其他药味会对这3种成分产生影响。目前关于此3种成分稳定性的相关报道较少，仅有研究表明，新芒果苷、芒果苷受热后化学结构发生变化，转化为其他成分[11]。本研究建立高效液相色谱分析方法，以3种成分作为指标，全面系统考察复幼方全方提取、不同配伍组合提取、盐知母单独提取过程中3种成分的变化情况，并对不同药味配伍提取后水提液中3种成分的稳定性进行研究，尝试阐明影响复幼方中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷提取率和稳定性的关键因素，并对复幼方提取中芒果苷不稳定的原因进行探讨，以期为其他含知母药材中药复方的研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DZTW型电子调温电热套（北京中仪泓瑞科技发展有限公司）；JY5002型电子天平（精度：0.01 g，上海衡平仪器仪表厂）；MS105DU型电子分析天平（精度：0.01 mg，梅特勒-托利多仪器有限公司）；FiveEasy Plus型pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；SB-5200DTD超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；LC-20AT型高效液相色谱仪（SPD-20A DAD检测器，LC Solution色谱工作站，日本岛津）。

1.2 试药

盐知母、生地黄、玄参、鳖甲、关黄柏、地骨皮、牡丹皮等药材均购于北京本草方源药物有限公司，经北京本草方源药物有限公司研究助理王颖鉴定。新芒果苷对照品（批号：C13S8G43633）、芒果苷对照品（批号：P04M9F60454）、异芒果苷对照品（批号：P10D10S105531）（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；娃哈哈纯净水，乙腈、甲醇为色谱纯（Fisher公司），实验用水为高纯水，冰乙酸分析纯（北京化工厂）。

2 方法与结果

2.1 3种成分含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 Agilent zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈-0.2%醋酸溶液（9∶91，V/V），检测波长：258 nm，流速：1.0 mL·min－1，柱温：30℃，进样量：10 µL。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取异芒果苷对照品1.39 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得异芒果苷母液。精密吸取1 mL异芒果苷母液并分别精密称取新芒果苷2.53 mg、芒果苷1.25 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取复幼方浸膏粉0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，称定重量，超声30 min，放冷，甲醇补足失重，摇匀，滤过即得。

2.1.4 专属性考察 制备不含盐知母的阴性样品溶液，取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液按“2.1.1”项下条件进样检测，结果见图2，表明阴性样品无干扰，方法专属性良好。

图2 混合对照品（A）、供试品（B）及阴性样品（C）的HPLC色谱图Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference substances（A），sample（B）and negative sample（C）

2.1.5 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.2”项下1、2、3、4、5、6、7 mL混合对照品溶液，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列质量浓度对照品溶液。按“2.1.1”项下条件进样检测，以质量浓度（mg·mL－1）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。新芒果苷、芒果苷和异芒果苷的回归方程分别为Y＝1.32×105X＋1.14×105（r＝0.9998）、Y＝1.05×105X＋8.44×104（r＝0.9998）、Y＝9.31×103X＋7.96×103（r＝0.9991），表明新芒果苷进样量在49.59～347.12 µg、芒果苷进样量在24.50～171.68 µg、异芒果苷进样量在2.72～19.07 µg与峰面积线性关系良好。

2.1.6 精密度试验 取同一份对照品溶液，按“2.1.1”项下条件连续进样6次，记录峰面积，计算RSD值。新芒果苷、芒果苷、异芒果苷峰面积RSD值分别为0.026%、0.057%、0.059%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验 平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下条件进样测定，结果供试品中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷含量分别为0.95、0.38、0.058 mg·g－1，RSD值分别为0.78%、0.74%、2.8%，表明本方法重复性良好。

2.1.8 加样回收试验 精密称取浸膏粉约0.25 g于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，共9份，分为3组。每组分别加入适量对照品母液使加入量与供试品中成分含量之比约为1.2∶1、1∶1和0.8∶1，进样测定各样品中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的含量，计算加样回收率，结果见表1。

表1 新芒果苷、芒果苷及异芒果苷的加样回收率(n＝3)Tab 1 Recovery of neomangiferin，mangiferin，and isomangiferin (n＝3)

2.2 药味配伍对3种成分提取率的影响

为考察方中各药味在提取过程中对盐知母中3种成分提取率的影响情况，将方中10味药材分别与盐知母配伍，按处方比例及优选工艺进行分别提取，并在相同条件下单独提取盐知母和复幼方，将上述水提液放冷后定容至等体积，平行操作两份。测定不同配伍水提液中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的峰面积，计算提取率，考察配伍对3种成分提取率的影响（本次实验用盐知母中新芒果苷的平均含量为11.06 mg·g－1，芒果苷的平均含量为10.25 mg·g－1，异芒果苷的平均含量为0.94 mg·g－1），结果见表2。

表2 不同药味与盐知母配伍提取后3种成分的提取率(%，n＝2)Tab 2 Extraction rate of 3 components of different compatibility medicinal with salt processed Rhizoma Anemarrhenae (%，n＝2)

提取率（%）＝[水提液中成分的浓度（mg·mL－1）×水提液体积（mL）]/[盐知母中该成分的平均含量（mg·g－1）×处方中盐知母用量（g）]×100%

结果表明复幼方中不同药味配伍会影响新芒果苷、芒果苷和异芒果苷的提取率，复幼方合提后新芒果苷、异芒果苷提取率高于盐知母单独提取，芒果苷提取率低于盐知母单独提取，3种成分的总提取率大于盐知母单独提取。生地黄与盐知母以处方比例合提对新芒果苷提取率影响最大。地骨皮与盐知母以处方比例合提对芒果苷提取率影响最大。方中各药味与盐知母以处方比例配伍合提后异芒果苷溶出均增加，提取率均高于盐知母单独提取。生地黄与盐知母以处方比例配伍合提后，3种成分的总提取率低于盐知母单独提取，方中其余药味与盐知母配伍合提后，3种成分的总提取率均大于盐知母单独提取。关黄柏、麦芽与盐知母以处方比例配伍合提后，3种成分的总提取率大于复幼方整方合提，方中其余药味与盐知母配伍合提后，3种成分的总提取率均低于复幼方整方合提。

2.3 药味配伍对3种成分稳定性的影响

为进一步考察药味配伍对新芒果苷、芒果苷、异芒果苷稳定性的影响，将方中各药材分别与盐知母配伍提取，并对复幼方进行合提，水提液放冷后定容至等体积，平行操作两份。测定不同配伍组合水提液在室温下放置0、2、4、6、8、10、12、24、48 h后新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的含量，取平均值。按照下式计算与0 h测得含量相比，48 h内各组水提液中的3种成分的含量，以百分比计。结果见图3和图4。含量（%）＝不同时间点各组样品测得含量/0时各组样品测得含量×100%。

图3 不同水提液放置48 h时3种成分的含量（n＝2）Fig 3 Contents of the 3 components in different water extracts placed for 48 h（n＝2）

图4 不同水提液放置48 h时3种成分的含量（n＝2）Fig 4 Contents of the 3 components in different water extracts placed for 48 h（n＝2）

结果表明复幼方水提液放置48 h后新芒果苷含量较稳定，芒果苷稳定性降低，含量下降15.96%，异芒果苷含量增加约23%。关黄柏-盐知母组水提液中新芒果苷的含量下降约6%，地骨皮-盐知母组水提液放置48 h后芒果苷、异芒果苷最不稳定，下降约8%和10%。对不同组别配伍提取后3种成分的总含量进行整体分析，夏枯草-盐知母组和地骨皮-盐知母组水提液中3种成分的总含量下降最明显，分别为19.0%和20.3%。提示关黄柏、夏枯草、地骨皮可能对复幼方中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的稳定性存在影响。

3 讨论

3.1 新芒果苷、芒果苷、异芒果苷在复幼方提取过程中的稳定性

知母作为清热泻火类中药在临床应用广泛，在前期提取工艺研究中，不同温度条件下，盐知母中3种双苯吡酮类成分新芒果苷、芒果苷和异芒果苷在单体溶液及盐知母水提液中稳定性良好，而在复幼方提取过程中受温度、加热时间和放置时间的影响，在超过60℃的提取条件下，3种成分的含量随加热温度的升高和受热时间的延长而降低，提示复幼方在生产过程中应该注意控制温度和受热时间，温度不宜过高，不宜长时间加热且提取后不宜长时间放置。有文献报道芒果苷在中性和微酸性条件下结构稳定，碱性条件下分子结构会发生变化[12]，测定3种双苯吡酮类成分对照溶液、盐知母饮片水提液、复幼方水提液的pH，结果显示3种双苯吡酮类成分对照品溶液pH基本一致，盐知母水提液和复幼方水提液pH接近，分别为4.88和5.12，因此排除复幼方水提液整体pH的影响，猜测为复方中药味配伍的作用。

3.2 复幼方药味配伍对新芒果苷、芒果苷、异芒果苷提取率的影响

中药复方配伍是以中医药学理论为指导进行临床用药的主要形式，药味中的有效成分是其发挥临床疗效的物质基础，通过现代科学技术手段探究中药复方中有效成分的变化，对中药复方的配伍和合理应用具有指导意义[13]。中药复方煎煮过程中，由于药味配伍的不同，溶液中的复杂成分可能由于形成缔合物、复合物等而使提取率发生变化。在本研究中，将复幼方中各味药材与盐知母按处方比例一一配伍后提取，结果显示不同的药味配伍会影响新芒果苷、芒果苷和异芒果苷的提取率，与方中其他配伍组合相比，生地黄、地骨皮与盐知母以处方比例配伍提取后，3种成分提取率均偏低。有文献报道[14]，知母与碱基类中药（地骨皮、桑白皮）、酚酸类中药（橘红、丹参）配伍合提，芒果苷提取率显著降低，生物碱类成分、氨基酸类成分对芒果苷提取率均有影响，这一报道与本文研究结果相符。另有研究表明，盐知母与关黄柏按1∶1比例配伍时，水提液中新芒果苷含量高于知母单煎，芒果苷含量降低[15]。本研究中盐知母与关黄柏的处方比例为3∶1，3种双苯吡酮类成分的提取率均大于盐知母单独提取，且异芒果苷＞芒果苷＞新芒果苷，说明不同的配伍比例同样会对有效成分提取率造成不同的影响。

3.3 复幼方药味配伍对新芒果苷、芒果苷、异芒果苷稳定性的影响

为进一步考察药味配伍对3种成分稳定性的影响，将方中10味药与盐知母按处方比例配伍提取，并对复幼方进行全方提取，测定不同配伍组合水提液和复幼方水提液在48 h内3种成分的含量，结果表明地骨皮、夏枯草与盐知母配伍使芒果苷、异芒果苷稳定性降低，新芒果苷在复幼方水提液中较稳定。有研究发现样品自然发霉后产生的菌株能够产生β-葡萄糖苷酶，使新芒果苷中β-葡萄糖键断裂转化为芒果苷[16]，复幼方水提液于室温下放置易发霉产生沉淀，48 h后芒果苷与异芒果苷含量变化呈相反趋势，猜测可能存在成分之间的转化，应进一步深入研究。

3.4 小结

本研究建立的新芒果苷、芒果苷、异芒果苷HPLC含量测定方法稳定可行，通过研究复幼方中药味配伍对3种成分提取率和稳定性的作用，阐明不同的药味配伍及配伍比例是影响复幼方中有效成分含量的关键因素。中药之间复杂的配伍作用不仅会对提取率造成影响，还会影响复方中有效成分在溶液中的稳定性。可根据发挥药效的有效成分不同，对药味配伍及配伍比例进行科学地调整，使复方发挥更好的功效。