巴山重楼的皂苷类化学成分研究

樊培，陆云阳，刘杨，刘文章，胡晋铭，田韵远，李天怡，赫雪锋，2，汤海峰*（.空军军医大学药学系中药与天然药物学教研室，西安 70032；2.解放军第九六八医院，北京 22000）

重楼属植物属于百合科（Liliaceae，亦有将其归为延龄草科Trilliaceae），共有26种14余变种和若干变型，我国约有20种10余变种[1-2]。2020年版《中国药典》收载的药用重楼为七叶一枝花和云南重楼，主产于四川、云南、陕西等地，具有清热解毒、消肿止痛和凉肝定惊的功效，用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、虫蛇咬伤、跌扑伤痛等疾病[3]。

巴山重楼（Paris bashanensis）作为重楼属的一种，主要分布在湖北和四川[4]，土家族通常用于头痛、高血压、蛇咬伤和痢疾的治疗[5]。经作者实地考察，发现在陕南（大巴山北侧腹地，东经109°11'～109°38'、北 纬31°42'～32°13'）也有分布。甾体皂苷是重楼的主要有效成分，但目前关于巴山重楼化学成分的研究报道有限，仅从中分离得到1个β-蜕皮激素、1个偏诺甾酮和3个偏诺皂苷[6]；此外，亦有关于其皂苷含量测定的报道，但不同报道的结果存在矛盾[7-8]，所以，对其化学成分的研究有待进一步完善。本文对巴山重楼根茎70%乙醇提取物的正丁醇萃取部位进行了化学研究，首次从中分离鉴定了7个甾体皂苷（见图1）。

图1 化合物1～7的化学结构Fig 1 Structures of compound 1－7

1 材料

Bruker AVANCE 800型核磁共振波谱仪（Bruker公司）；Quatrro质谱仪（Waters公司）；戴安P680高效液相色谱仪（P680系列单泵、UVVIS检测器、CHROMELON工作站）、YMC-ActusTriart C18半制备色谱柱（20 mm×250 mm，5 μm）、ODS C18柱（Pharmacia公司）；Grace Reveleris X2 Flash 中低压制备色谱仪、Sephadex LH-20凝胶（GE公司）；薄层色谱用硅胶G、柱层析色谱硅胶（100～200目、200～300目，青岛海洋化工厂）；电子天平（精度：0.0001 g，赛多利斯科学仪器有限公司）；低温冷却循环泵（DLSB-40型，陕西爱信仪器有限公司）；隔膜真空泵（V-100 型，瑞士BUCHI公司）；旋转蒸发仪（N-1100型）、电热恒温水浴锅（OSB-2100型，上海爱朗仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（DHG-924OA型，上海一恒科学仪器有限公司）；色谱纯甲醇、乙腈（天津科密欧公司）；氘代试剂（Merck 公司）；显色剂（10%硫酸/乙醇）；其他试剂均为分析醇。

药材于2018年9月采自陕西省安康市镇坪县，经空军军医大学药学系中药与天然药物学教研室汤海峰教授鉴定为巴山重楼（Paris bashanensisWang et Tang）的根茎，药材标本（编号：20189013）保存在空军军医大学药学系中药与天然药物学教研室标本室。

2 提取与分离

干燥的巴山重楼根茎0.8 kg，用70%乙醇浸泡过夜，回流提取5次，每次2 h，减压回收溶剂得醇提浸膏210 g。将浸膏加适量水分散，用等体积石油醚萃取5次，再用等体积水饱和正丁醇萃取6次，回收正丁醇层得到总皂苷160 g。总皂苷经硅胶柱色谱，用V二氯甲烷∶V甲醇∶V水（80∶1∶0～65∶35∶10）梯度洗脱，得到25个组分（Fr.1～Fr.25）。其中 Fr.18（17.6 g）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱除去水溶性杂质后，再经反相硅胶柱色谱，V甲醇∶V水（80∶20～40∶60，v/v）梯度洗脱，得到Fr.18-1～Fr.18-3。Fr.18-1通过半制备高效液相色谱分离纯化，80%甲醇洗脱得到化合物1（35.0 mg）和化合物2（9.6 mg）；Fr.18-2通过半制备高效液相色谱分离纯化，65%甲醇洗脱得到化合物3（56.0 mg）、化合物4（7.0 mg）和化合物5（11.0 mg）。Fr.17（10.0 g）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱除去水溶性杂质后，经ODS反相柱色谱，V甲醇∶V水（80∶20～40∶60）梯度洗脱得到Fr.17-1～Fr.17-2。Fr.17-1通过半制备高效液相色谱分离纯化，70%乙腈洗脱得到化合物6（4.5 mg）和化合物7（5.3 mg）。

3 结构鉴定[9-18]

化合物1：白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish鉴定反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。电喷雾质谱（ESI-MS）显示其准分子离子峰为m/z1101 [M＋Na]＋（阳离子模式）和1077 [M-H]－（阴离子模式），结合化合物的13C-NMR谱（200 MHz，CD3OD）数据推断其分子式为C52H86O23。

分析化合物的13C-NMR和DEPT谱数据，发现其共有52个碳信号，其中27个碳信号归属于苷元部分。在1H-NMR谱（800 MHz，CD3OD）高场区显示5个甲基氢信号δH1.05（s）、0.85（s）、0.93（d，J＝7.0 Hz）、0.96（d，J＝6.8 Hz）和3.18（s），在HSQC谱中分别与δC19.8、17.6、9.8、17.2和47.5信号相关。NMR分析表明：化合物1的结构中还存在1个连氧亚甲基[δH3.39（m），3.74（t，J＝9.4 Hz）；δC75.9]、1个连氧次甲基（δH3.97；δC90.7）、1个三取代双键（δH5.38；δC122.6，δC141.8）、3个季碳（δC37.9、46.1和91.6）和1个半缩醛季碳（δC114.6）。通过HSQC、1H-1H COSY、HMBC、TOCSY分析，对苷元的碳氢信号进行了归属，结果见表1。在HMBC谱中，H-6（δH5.38）与C-5（δC141.8）之间的远程相关信号，表明存在双键Δ5（6），甲氧基氢δH3.18信号与C-22（δC114.6）信号的远程相关峰表明OCH3连接于C-22位。在NOESY谱中，H-5/H-9和H-5/H-3的NOE相关峰表明H-3是α构型，H-18/H-20和H-21/OCH3的NOE相关峰表明21-CH3和22-OCH3为α构型，H-14/H-16和H-16/OCH3的NOE相关峰推断H-14为α构型。通过H2-26化学位移值（δH3.78和3.43）的差异（ΔδH＝0.35＜0.48），可确定25R构型[18]。综合以上分析，确定1的苷元为22α-甲氧基-（25R）-呋甾-5-烯-3β，17α，26-三醇。

表1 化合物1～7的13C-NMR数据(200 MHz，1 in CD3OD，2～7 in C5D5N)Tab 1 13C-NMR data of compounds 1～7 (200 MHz，1 in CD3OD，2～7 in C5D5N)

取化合物11.5 mg加入2 mL三氟乙酸（2 mol·L－1），于120℃下加热2 h，蒸干溶剂，向反应物中加入CH2Cl2和H2O进行萃取。蒸干水层，向残留物中加入1 mL无水吡啶和2 mLL-半膀胱氨酸甲酯盐酸盐的无水吡啶溶液（0.1 mol·L－1），60℃加热2 h，氮气吹干；加入1 mL吡啶和0.5 mLN-（三甲基硅基）咪唑，60℃加热1 h；蒸干溶液，用正己烷和水萃取，正己烷层进行GC分析。标准糖用同样方法制备单糖衍生物作为对照。经分析，确定化合物1的单糖组成为D-葡萄糖和L-鼠李糖（1∶1）。在13C-NMR谱中显示4个糖的端基碳信号δC100.3、102.2、102.8和104.5，与1H-NMR谱中的端基氢信号δH4.51（d，J＝8.9 Hz）、5.21（d，J＝1.6 Hz）、4.87（d，J＝1.3 Hz）和4.25（d，J＝8.5 Hz）分别对应。由GlcⅠ和GlcⅡ的端基氢耦合常数可知2个葡萄糖形成的苷键均为β构型；RhaⅠ和RhaⅡ的C-5化学位移分别为δC69.7和69.5，可知2个鼠李糖形成的苷键均为α构型[9-10]。通过HMBC分析发现H-3（δH3.70）与GlcⅠC-1（δC104.5）存在远程相关，说明GlcⅠ连接于苷元C-3位；RhaⅠH-1（δH5.21）与GlcⅠC-2（δC79.3）的远程相关，以及RhaⅡH-1（δH4.87）与GlcⅠC-4（δC79.7）的远程相关，表明RhaⅠ和RhaⅡ分别连接于GlcⅠ的2位和4位；H-26（δH3.78）与GlcⅡC-1（δC100.3）的远程相关信号，表明GlcⅡ连接于C-26位。与文献[11]报道的化合物lycianthoside A的波谱数据进行对照，基本一致，从而确定化合物1为lycianthoside A。

化合物2：白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish鉴定反应呈阳性，初步判断该化合物是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰m/z1085[M＋Na]＋（阳离子模式）和1061[M-H]－（阴离子模式）。结合13C-NMR（200 MHz，C5D5N）推断其分子式为C52H86O22。在1H-NMR（800 MHz，C5D5N）高场区中存在5个甲基氢信号δH1.05（s）、0.85（s）、0.93（d，J＝7.04 Hz）、0.96（d，J＝6.8 Hz）和3.18（s），分别与13C-NMR中的δC16.6、19.8、16.7、17.5和47.6信号对应。NMR分析表明，化合物2的结构中还存在1个连氧亚甲基[δH3.39（m），3.74（m）；δC75.6]、1个连氧次甲基（δH3.97；δC81.7）、1个三取代双键（δH5.38；δC141.2，δC123.2）和1个半缩醛季碳（δC113.0）。在HMBC谱中H-7（δH5.42）与C-6（δC141.2）的远程相关信号表明存在双键Δ5（6）。通过2D-NMR分析归属了化合物2的碳氢信号，与化合物1基本一致，区别在于化合物2的C-17为不连氧的叔碳，这表明其17位无羟基取代；结合分子式进一步确定了这一推断。将化合物2按照化合物1相同的方法酸水解后制备成单糖衍生物，通过GC分析表明化合物2的单糖组成同样为D-葡萄糖和L-鼠李糖（1∶1）；NMR分析表明糖基部分的碳氢信号与化合物1一致。因此，确定了化合物2的化学结构，即已知化合物methylprotodioscin，波谱数据与文献报道一致[12]。

化合物3：白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish鉴定反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰m/z907 [M＋Na]＋（阳离子模式）和883[M-H]－（阴离子模式），结合13C-NMR（200 MHz，C5D5N）谱推断其分子式为C45H72O17。13C-NMR和DEPT谱分析表明，该化合物45个碳信号中有27个碳信号归属于苷元部分。在1H-NMR（800 MHz，C5D5N）谱高场区中存在4个甲基氢信号δH1.09（s）、0.69（s）、1.24（d，J＝7.1 Hz）和0.96（d，J＝5.8 Hz），分别与13C-NMR中δC20.0、17.6、10.3和17.8信号对应。化合物3的NMR谱中还存2个季碳信号（δC37.6，45.6）和1组三取代烯烃信号（δH5.30；141.2和δC122.3）。HMBC中H-6（δH5.31）与C-5（δC141.2）显示远程相关，表明存在双键Δ5（6）；CH3（δH1.24）与C-20（δC45.3）的远程相关峰则表明21-CH3连接于C-20位。化合物3的A环～D环NMR数据与化合物1基本一致，但δC67.2（C-26）和110.3（C-22）等关键信号表明化合物3存在F环的闭环。经文献对照，确定化合物3的苷元是常见的偏诺皂苷元[13]。

将化合物3按照化合物1相同的方法酸水解后制备成单糖衍生物，通过GC分析确定其单糖组成为D-葡萄糖和L-鼠李糖（1∶2）。13C-NMR谱显示3个糖的端基碳信号δC100.7、102.5和103.4，与1H-NMR谱中3个端基氢信号δH4.94（d，J＝9.7 Hz）、5.96（d，J＝2.3 Hz）和5.47（d，J＝1.7 Hz）分别对应。通过HMBC谱分析确定了糖的连接方式，H-3（δH3.86）与GlcⅠC-1（δC100.7）的远程相关信号表明GlcⅠ连接于苷元C-3位，RhaⅠH-1（δH5.96）与GlcⅠC-2（δC78.4）的远程相关，以及RhaⅡH-1（δH5.47）与GlcⅠC-4（δC79.0）的远程相关表明RhaⅠ和RhaⅡ分别连接于GlcⅠ的2位和4位。化合物3在糖基部分的NMR数据与化合物1的3位糖链一致。通过与文献[13]中报道的化合物5的波谱数据对比，确认化合物3的化学结构为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物4：白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish鉴定反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰m/z891 [M＋Na]＋（阳离子模式）和867 [M-H]－（阴离子模式），结合13C-NMR（200 MHz，C5D5N）推断其分子式为C45H72O16。

将化合物4按照化合物1相同的方法酸水解后制备成单糖衍生物，通过GC分析确定化合物4的单糖组成为D-葡萄糖和L-鼠李糖（1∶2）。将化合物4与化合物3的NMR数据对比，发现两者在糖链部分的数据一致；苷元部分的信号也基本一致，如4个甲基信号[δH1.07（s），0.85（s），1.15（d，J＝6.9 Hz），0.71（d，J＝5.7 Hz）；δC16.9，20.0，16.0，17.9）、2个季碳信号（δC37.7，41.0）、1个半缩醛碳的特征信号（δC109.8）和1组三取代烯烃信号[δH5.34（br d，J＝3.0 Hz）；δC141.3，122.3]等。但是，化合物4的C-17由δC90.6向高场位移至73.4，以及相邻的C-13、C-16、C-20的化学位移，表明化合物4的C-17位无羟基取代，结合分子式得到验证。经与文献数据对照[14]，基本一致，从而确定化合物4为已知化合物borassoside E。

化合物5：白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish鉴定反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰m/z941 [M＋Na]＋（阳离子模式）和917 [MH]－（阴离子模式），结合据13C-NMR谱推断其分子式为C45H74O19。1H-NMR谱（800 MHz，C5D5N）显示有5个甲基氢信号δH0.86（s）、0.80（s）、0.95（d，J＝6.2 Hz）、0.98（d，J＝5.4 Hz）和3.17（s），与13C-NMR谱（200 MHz，C5D5N）中的δC15.5、13.2、14.9、15.8和47.7信号分别对应。在HMBC谱中，δH3.17信号与C-22（δC112.9）信号的远程相关峰表明OCH3连接于C-22位，δH0.95信号与C-20（δC40.8）信号的远程相关峰表明21-CH3连接于C-20位。上述数据与化合物1的苷元基本一致，区别在于化合物5的13C-NMR谱中无Δ5（6）信号，但多处羰基碳信号（δC213.3）。在HMBC谱中观察到H-7（δH2.16）与该羰基碳的远程相关信号，结合C-6周围碳的化学位移变化分析，推断羰基位于C-6位，从而确定了化合物5的苷元结构。

将化合物5按照化合物1相同的方法酸水解后制备成单糖衍生物，通过GC分析确定化合物5的单糖组成为D-葡萄糖和L-阿拉伯糖（2∶1）。在13C-NMR谱中存在3个糖的端基碳信号δC100.9、103.8和103.1，与1H-NMR谱的3个端基氢信号δH4.42（d，J＝8.7 Hz）、4.34（d，J＝6.1 Hz）和5.47（d，J＝7.7 Hz）相对应。通过GlcⅠ、GlcⅡ和Ara的端基氢耦合常数，确定葡萄糖形成苷键的相对构型均为β构型，阿拉伯糖为α构型。在HMBC谱中可见H-3（δH3.40）与GlcⅠC-1（δC100.9）的远程相关信号，表明GlcⅠ连接于苷元C-3处；Ara H-1（δH4.34）与GlcⅠC-6（δC62.3）、以及H-26（δH3.72）与GlcⅡC-1（δC103.1）的远程相关信号，则表明Ara连接于GlcⅠC-6，而GlcⅡ连接于苷元C-26位。与文献报道的化合物1的波谱数据[15]比较，基本一致，从而确定化合物5的化学结构为26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β，26-二羟基-22-甲氧基-（25R）-5α-呋甾-6-酮-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-（1→6）-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物6：白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish鉴定反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰m/z1277 [M＋Na]＋（阳离子模式）和 1253[M-H]－（阴离子模式），结合13C-NMR（200 MHz，C5D5N）推断其分子式为C58H94O29。13C-NMR和DEPT谱分析表明，该化合物58个碳信号中有28个归属于苷元部分。在1H-NMR（800 MHz，C5D5N）谱高场区中存在5个甲基氢信号δH1.38（s）、1.08（m）、0.85（s）、0.83（s）和3.15（s），分别与13C-NMR谱中的δC17.2、17.3、19.1、15.1和48.5信号对应。化合物6的NMR谱中还存在2组三取代双键信号[δC140.5和121.5，δH5.38（m）；δC157.3和98.5，δH4.42（m）]。在HMBC中H-6（δH5.21）与C-5（δC140.5）显示远程相关，表明存在双键Δ5（6）；δH0.83甲基信号与C-20（δC83.2）的远程相关峰则表明21-CH3连接于C-20位。通过2D-NMR分析归属了化合物6的碳氢信号，苷元A～D环的数据与化合物2基本一致，但F环和侧链部分存在差异。在HMBC谱中，H-23（δH4.31）与C-22（δC157.3）显示远程相关，表明存在双键Δ22（23），而OCH3（δH3.15）与C-20（δC83.2）的远程相关峰则表明OCH3连接于C-20位。在NOESY谱中，H-17与H-21的NOE相关峰表明C-20处的甲氧基为β构型。综上所述，确定了化合物6的苷元结构。

将化合物6按照化合物1相同的方法酸水解后制备成单糖衍生物，通过GC分析确定其单糖组成为D-葡萄糖和D-半乳糖（4∶1）。13C-NMR谱显示5个端基碳信号δC102.7、105.2、105.3、104.8和104.4，与1H-NMR谱5个端基氢信号δH5.55（d，J＝7.9 Hz）、5.21（d，J＝9.2 Hz）、5.20（d，J＝7.8 Hz）、5.10（d，J＝8.3 Hz）和4.98（d，J＝7.5Hz）分别对应。由GlcⅠ～GlcⅣ和Gal的端基氢耦合常数可知4个葡萄糖和半乳糖所形成的苷键均为β构型。通过HMBC分析发现，H-3（δH3.79）与Gal C-1（δC102.7）存在远程相关，说明Gal连接于苷元C-3位；GlcⅠH-1（δH5.21）与Gal C-4（δC80.0）存在远程相关，GlcⅡH-1（δH5.20）与GlcⅠC-2（δC79.2）存 在远程相关，GlcⅢ H-1（δH5.10）与GlcⅠC-3（δC79.8）存在远程相关，从而确定GlcⅠ连接于Gal的4位，GlcⅡ和GlcⅢ分别连接于GlcⅠ的2位和3位；H-26（δH3.68）与GlcⅣ C-1（δC104.4）的远程相关信号，则表明GlcⅣ连接于C-26位。与文献报道的allimacroside E的波谱数据[16]进行对照，基本一致，从而确定了化合物6的化学结构为allimacroside E。

化合物7：白色无定形粉末Lieberman-Burchard和Molish鉴定反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰m/z893 [M＋Na]＋（阳离子模式）和869[M-H]－（阳离子模式），结合13C-NMR（200 MHz，C5D5N）推断其分子式为C44H70O17。13C-NMR和DEPT谱分析表明，该化合物44个碳信号中有27个碳信号属于苷元部分。在1H-NMR（800 MHz，C5D5N）谱高场区中存在4个甲基氢信号δH1.02（s）、0.83（s）、1.15（d，J＝6.9 Hz） 和 0.71（d，J＝5.7 Hz），分别与13C-NMR谱中δC16.7、19.0、15.3和 17.3信号对应。化合物7的NMR谱中还存在2个季碳的信号（δC37.5，41.1）、1个半缩醛碳特征信号δC110.3和一组三取代烯烃信号[δH5.34（br d，J＝2.8 Hz）；δC141.5，129.1]。在HMBC中，H-6（δH5.26）与C-5（δC141.5）显示远程相关，表明存在双键Δ5（6）。通过2D-NMR分析归属了化合物7的碳氢信号，与化合物4的苷元基本一致，区别在于化合物7的C-7为连氧叔碳，向低场位移，结合分子量推断7位连接了1个羟基。通过H-7/H-8和H-7/H-15的NOE相关峰推断7-OH为α构型。从而确定了化合物7的苷元结构。

将化合物7按照化合物1相同的方法水解后制备成单糖衍生物，通过GC分析确定其单糖组成为D-葡萄糖、L-阿拉伯糖和L-鼠李糖3种单糖（1∶1∶1）。13C-NMR谱中存在3个糖的端基碳信号δC100.3、102.7和109.5，与1H-NMR谱中的3个端基氢信号δH5.20（d、J＝7.8 Hz）、6.15（J＝1.7 Hz）和5.85（s）分别对应。通过HMBC谱确定了糖的连接方式：H-3（δC5.67）与GlcⅠC-1（δC100.3）存在远程相关信号，说明GlcⅠ连接于苷元C-3位；RhaⅠH-1（δH6.15）与GlcⅠC-2（δC78.2）的远程相关，以及Ara H-1（δH5.85）与GlcⅠC-4（δC77.8）的远程相关表明RhaⅠ与Ara分别连接于GlcⅠ的2位和4位。通过与文献[17]报道的化合物1的波谱数据对比，基本一致，从而确定物7的化学结构为（25R）-螺甾-5-烯-3β，7α-二醇-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

4 结果与讨论

巴山重楼目前属于近危植物[19]，一方面由于其较高的药用价值，当地民众对于其需求日益增加，另一方面，药用重楼的需求量逐年上升，从植物形态学角度判断，重楼属植物种之间非常容易出现混种、替代以及质量不可控等问题，而巴山重楼可能出现种间替代，造成其资源急剧下降。出于保护基源物种和药用资源可持续发展的目的，对其化学成分进行了研究，本文首次从中发现了7个皂苷类化合物。预实验表明，巴山重楼含有种类丰富的皂苷成分，可能还存在一些新化合物，将进一步对其进行更深入的化学研究，以为其资源合理开发应用提供科学依据。