藏药喜马拉雅紫茉莉的分子光谱鉴别与质量评价研究

翟小林，王丹，赵禾笛，戚苗，宫源，王艳敏，陈建波，王晶娟*（.北京中医药大学中药学院，北京 02488；2.北京中医药大学生命科学学院，北京 02488；.北京中医药大学中医学院，北京 02488）

喜马拉雅紫茉莉为紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica（Edgew.）Heim.的干燥根[1]，在藏医中名为巴朱，具引黄水、益肾滋补、利尿排石等功效，常用于治疗腰痛、关节痛、水肿、淋病、肾炎、阳痿、子宫癌等病[1-3]。喜马拉雅紫茉莉为藏医常用药，用药历史悠久，在多种藏医成药中为主要药味。现代研究表明，喜马拉雅紫茉莉中含有鱼藤酮类、葫芦巴碱、三萜、胡萝卜苷、β-谷甾醇、挥发油、甾体、不饱和脂肪酸等成分[4-6]。

喜马拉雅紫茉莉现有质量标准仅有性状和显微鉴别[1]，缺少客观量化的理化指标。根据喜马拉雅紫茉莉“粉末灰白色、淀粉粒众多、草酸钙针晶众多”等特征[1]，本研究选择可见光谱、红外光谱作为理化鉴别方法。药材外观颜色是质量评价的重要指标，药材的色度往往与质量相关[7-8]。故本试验在传统鉴别的基础上，以不同产地药材粉末色度值为切入点，再结合表征药材整体成分的红外光谱，既可探究不同产地喜马拉雅紫茉莉的外在差异，又能反映显微特征（淀粉粒、草酸钙）及潜在的药效物质群信息，根据光谱图的改变可反映中药化学成分的变化与差别[9-10]，红外光谱法也是现在应用较多的药材鉴别方法[11-15]。

除存在缺少客观量化的理化指标的问题外，喜马拉雅紫茉莉与紫茉莉等易混淆品间的快速区分问题也亟待解决。喜马拉雅紫茉莉与紫茉莉同为紫茉莉科植物，在本草中有将两者混淆记载的情况[6]。且在紫茉莉的化学研究中也发现，其含有鱼藤酮类、β-谷甾醇、葫芦巴碱、豆甾醇、萜类等活性成分[16]，与喜马拉雅紫茉莉的化学成分具有相似性。因此，本试验除通过可见光谱、红外光谱等分析手段对藏药喜马拉雅紫茉莉进行鉴别与质量的初步评价外，还通过红外特征图谱实现了喜马拉雅紫茉莉与紫茉莉的快速鉴别。

1 材料

喜马拉雅紫茉莉样品16批（编号：S1～S16），紫茉莉样品12批（编号：ZML1～ZML 12），均为自采药材，经北京中医药大学王晶娟教授鉴定为紫茉莉科紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica（Edgew.）Heim.和紫茉莉Mirabilis jalapaL.的干燥根。水合氯醛（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙醇（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）。

KQ-500DE（数控超声仪，昆山市超声仪器有限公司，500 W，40 kHz），DZF-6022真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），LEICA DM500正置显微镜（德国徕卡仪器有限公司），OLYMPUS cellSens Standard 2.1成像系统，CM-5型分光测色仪（日本柯尼卡美能达公司），VERTEX 70傅里叶变换红外光谱仪（德国布鲁克公司）。

2 方法

2.1 浸出物含量测定

取不同批次喜马拉雅紫茉莉各1.0 g（过24目筛），精密称定，置于100 mL锥形瓶中，加入40 mL 61%乙醇，称定重量，于超声仪超声提取65 min，放冷后再次称定重量，用61%乙醇补足失重，精密称取滤液30 mL置于干燥失重的蒸发皿中，水浴蒸干后，按照2020年版《中国药典》[17]2201项下浸出物测定方法进行后续操作。

2.2 性状和显微鉴别

① 性状鉴别：对喜马拉雅紫茉莉及紫茉莉的形状、表面特征、质地、断面、气味等方面进行观察和描述，采用电子数显卡尺测量其直径和厚度。

② 显微鉴别：取喜马拉雅紫茉莉及紫茉莉粉末制成水合氯醛临时装片，于显微镜40倍目镜下通过显微成像系统观察其显微特征。

2.3 可见光谱法

将不同批次的喜马拉雅紫茉莉药材表面的泥沙、灰尘等清理干净，打粉过24目筛，测试时将粉末放在圆形玻璃测色皿中，使测色皿中平铺药材粉末，以粉末充分覆盖皿底部不透光为宜。为避免误差，每次测样时应放入重量相近的粉末。将标准白板放入测量仪器中的样品槽和参比槽进行基线校正，待校正通过后，将样品放入测色皿中测定，并记录样品颜色各项指标值（L*、a*、b*值），每个样品平行测定3次。

2.4 红外光谱法

取喜马拉雅紫茉莉和紫茉莉粉末样品，过65目筛；喜马拉雅紫茉莉浸出物样品为浸出物的干燥粉末，不过筛。光谱测量范围4000～400 cm－1，光谱分辨率4 cm－1，每张光谱累计扫描32次，扣除水蒸气与CO2的背景干扰。

3 结果

3.1 性状和显微鉴别

根据“2.2”项下操作方法进行性状及显微鉴别，喜马拉雅紫茉莉的性状及显微特征与《部颁标准》[1]项下喜马拉雅紫茉莉的相关描述一致。从性状特征方面来说，两者在形状、外观颜色、断面颜色、质地等方面均有一定的区别，具体结果见表1～2。

表1 喜马拉雅紫茉莉与紫茉莉性状特征Tab 1 Character characteristics of Mirabilis himalaica and Mirabilis jalapa

表2 喜马拉雅紫茉莉与紫茉莉显微特征Tab 2 Microscopic characteristics of Mirabilis himalaica and Mirabilis jalapa

在显微特征方面，两者均具有草酸钙针晶束、网纹导管、薄壁细胞等特征，区别不明显，但与喜马拉雅紫茉莉相较，紫茉莉中淀粉粒常糊化，且不具有棕色的木栓细胞，具体结果见图1～2。

图1 喜马拉雅紫茉莉粉末Fig 1 Powder characteristics of Mirabilis himalaica

图2 紫茉莉根粉末Fig 2 Powder characteristics of Mirabilis jalapa

3.2 喜马拉雅紫茉莉粉末色度值研究

在喜马拉雅紫茉莉表面及断面颜色观察结果的基础上，对16批样品粉末进行色度值分析，色度指标L*、a*、b*值分别代表粉末颜色的明暗度，红绿色和黄蓝色，具体结果见表3。

由表3可知，样品表面颜色较深（棕褐色）时，粉末色度指标b*值较小，断面颜色偏浅色（类白色）时，粉末色度指标L*值较高，粉末色度指标a*值较低。色度指标L*值的范围为60.47～78.40，a*值的范围为2.75～5.03，b*值的范围为13.60～17.08。主观描述与色度值测量两种方法的结果具有较好一致性。

表3 不同批次喜马拉雅紫茉莉L＊、a＊、b＊值及表面和断面颜色(n＝3)Tab 3 L＊，a＊，b＊ value and surface and transect color of different batches of Mirabilis himalaica (n＝3)

3.3 红外光谱检测结果

3.3.1 喜马拉雅紫茉莉药材红外指纹图谱的建立

取16批喜马拉雅紫茉莉药材，按“2.4”项下方法制样，测定，获得红外指纹图谱，重叠图谱见图3。用平均值法获得16批（S1～16）喜马拉雅紫茉莉药材共有模式图谱作为对照图谱[18]，见图3。

图3 不同批次喜马拉雅紫茉莉红外光谱（B）及其红外平均光谱（A）Fig 3 Infrared spectrum（B）and average infrared spectrum（A）of Mirabilis himalaica of different batches

从图3可看出，16批喜马拉雅紫茉莉药材原始红外光谱图其峰形、峰位基本相同，表明主要化学成分类似。喜马拉雅紫茉莉不同样品的红外光谱相似度在0.975～0.996，表明其一致性好，可以作为指纹图谱。3487 cm－1、3421 cm－1、3340 cm－1、3063 cm－1、1607 cm－1、1318 cm－1、1007 cm－1、782 cm－1、521 cm－1为喜马拉雅紫茉莉药材的主要特征指纹峰。

3.3.2 喜马拉雅紫茉莉药材与紫茉莉红外图谱比较 采用平均值法获得12批紫茉莉药材（ZML 1～ZML12）的共有模式图谱，对比观察喜马拉雅紫茉莉和紫茉莉共有模式图谱（见图4）可以发现，在3670～2160 cm－1内喜马拉雅紫茉莉和紫茉莉的红外光谱峰形相似，但后者吸收强度较高。在1600～1000 cm－1波长内，两者的峰形和吸收强度均有差异。对照草酸钙与淀粉图谱可知，喜马拉雅紫茉莉和紫茉莉的红外色谱图中，草酸钙和淀粉的信号吸收强度较高，其中紫茉莉的淀粉吸收强度高于喜马拉雅紫茉莉，而草酸钙信号强度基本一致。

图4 喜马拉雅紫茉莉及紫茉莉的平均红外光谱及淀粉、草酸钙的红外光谱Fig 4 Average infrared spectra of Mirabilis himalaica and Mirabilis jalapa，infrared spectrum of starch and calcium oxalate

3.3.3 喜马拉雅紫茉莉药材与紫茉莉红外图谱相似度分析 使用红外软件spectrum，以喜马拉雅紫茉莉1600～1000 cm－1内的共有模式图谱为对照图谱，对喜马拉雅紫茉莉和紫茉莉进行相似度计算（见表4及5）。相似度1.0表示两个光谱之间完全匹配，即两个光谱的数据集相同。零相似度表示两个光谱完全不相关。相关系数通过以下表达式计算：相似度＝∑ωiAiBi/[（∑ωiAiBi）1/2×（∑ωiAiBi）1/2]。

表4 喜马拉雅紫茉莉相似度评价结果Tab 4 Similarity evaluation of Mirabilis himalaica

其中Ai和Bi表示光谱A和B在频率i下的吸光度值，ωi表示取决于所选过滤器的加权。在使用多个过滤器时，总加权等于各过滤器加权的乘积。

结果显示，不同批次喜马拉雅紫茉莉相似度均在0.990以上，平均值为0.997；紫茉莉相似度均不高于0.982，平均值为0.959。此结果说明了喜马拉雅紫茉莉不同批次间的一致性比较好，且与紫茉莉有一定的差异。

3.3.4 喜马拉雅紫茉莉与紫茉莉红外光谱数据的聚类分析 利用统计软件SAS对喜马拉雅紫茉莉和紫茉莉共28批药材的相似度大小进行R聚类分析（见图5）。结果显示S1～S16被聚为一类，ZML1～ZML12（图中显示为Z1～Z12）为另一类，表明喜马拉雅紫茉莉与紫茉莉的红外光谱之间存在较明显差异。

表5 紫茉莉相似度评价结果Tab 5 Similarity evaluation of Mirabilis jalapa

图5 喜马拉雅紫茉莉与紫茉莉红外图谱聚类分析Fig 5 Clustering analysis of the infrared spectrum of Mirabilis himalaica and Mirabilis jalapa

3.4 喜马拉雅紫茉莉浸出物含量测定及红外检测结果

3.4.1 浸出物含量测定结果 对不同批次喜马拉雅紫茉莉的浸出物含量进行测定，具体结果见表6。由表6可知，喜马拉雅紫茉莉的浸出物含量分布在15.44%～26.47%，以最低含量下调30%[19]来计算，可将浸出物含量不低于10.81%作为喜马拉雅紫茉莉浸出物含量指标。

表6 不同批次喜马拉雅紫茉莉浸出物含量Tab 6 Content of extracts from different batches of Mirabilis himalaica

3.4.2 浸出物含量与色度指标（L*、a*）相关性分析 将喜马拉雅紫茉莉浸出物含量与L*值、a*值进行相关性分析（见图6），发现浸出物含量随色度指标L*值的增大而增加，成正相关；随a*值的增加而降低，成负相关。说明色度指标不仅可以用于药材鉴别，还有可能作为其浸出物含量高低的初步评价指标。

图6 喜马拉雅紫茉莉浸出物含量与色度指标（L*、a*）关联性分析Fig 6 Correlation between the content of extracts and color index（L*，a*）of Mirabilis himalaica

3.4.3 浸出物红外指纹图谱的建立 取16批喜马拉雅紫茉莉浸出物粉末，按“2.1”项下方法制样，测定，获得红外指纹图谱，用平均值法获得16批喜马拉雅紫茉莉浸出物共有模式图谱[18]，见图7。由图7可知，波长3284 cm－1、2927 cm－1、2855 cm－1、1728 cm－1、1600 cm－1、1390 cm－1、1323 cm－1、1280 cm－1、1202 cm－1、1102 cm－1、1045 cm－1、990 cm－1、924 cm－1、854 cm－1、667 cm－1为喜马拉雅紫茉莉紫茉莉浸出物的主要特征指纹峰。

图7 喜马拉雅紫茉莉紫茉莉浸出物红外图谱Fig 7 Infrared spectrum of extracts Mirabilis himalaica

将不同批次喜马拉雅紫茉莉紫茉莉浸出物的主要特征峰的吸光度值（X）分别与浸出物含量（Y）进行线性回归分析，发现1600 cm－1、1390 cm－1、1323 cm－1、1280 cm－1、924 cm－1波长处R2均在0.700以上，在1323 cm－1波长处Y＝－65.705X＋55.969（R²＝0.8159）。因此，可在红外吸光度值分析基础上，结合“2.1”项下浸出物含量指标进行喜马拉雅紫茉莉初步质量评价。

淀粉在波长1152 cm－1处有红外吸收，草酸钙在1318 cm－1和782 cm－1波长处有明显吸收（见图4），而喜马拉雅紫茉莉浸出物红外光谱在相应波长处则无明显吸收峰（见图7），因此喜马拉雅紫茉莉浸出物红外图谱可更好地作为包含潜在药效物质信息的指纹图谱。

4 讨论

指纹图谱是以系统的化学成分研究为依托，以较强的系统性和选择性来特征性地区分中药的真伪、优劣，将待测样品指纹图谱与已建立的对照图谱进行相似性比较，从而对药品质量进行控制和评价[11，20-21]。红外光谱作为中药鉴别的辅助手段，近年来发展较快，有成本低、操作便捷等特点，已成为鉴定和分析不同产地药材及内在质量的重要手段[13，22]。

红外光谱具有不破坏试样、试样用量少、操作简便、测定快速和多组分同时测定等优点，可综合反映药材所含的整体化学成分，在一定程度上可整体反映药材内在质量的均一性。本研究采用红外光谱技术建立了喜马拉雅紫茉莉药材红外光谱指纹图谱，由于喜马拉雅紫茉莉药材粉末的红外光谱中淀粉和草酸钙信号占主导，因此本研究增加了浸出物红外光谱作为喜马拉雅紫茉莉质量评价指标，相较于药材的红外光谱，浸出物红外光谱中可除去淀粉与草酸钙的红外吸收，因此可更好地反映喜马拉雅紫茉莉的药效成分的信号吸收，且浸出物红外光谱整体有更强的吸收强度，检测更加灵敏。

喜马拉雅紫茉莉外观及断面颜色与可见光谱色度指标值具有相关性，浸出物含量与色度指标也具有较好一致性，表明可见光谱客观量化值可以作为质量评价的参考指标反映喜马拉雅紫茉莉的内在质量。可见光谱法可以客观量化描述颜色特征，减少不同研究者对药材颜色判断的主观性误差。本研究选择可见光谱、红外光谱对喜马拉雅紫茉莉进行鉴别与质量的初步评价，并建立了喜马拉雅紫茉莉与紫茉莉的快速评价方法，以期为喜马拉雅紫茉莉的质量评价提供量化指标和参考依据。