基于多指标综合评分法优化丹骨颗粒成型工艺

莫诺兰，丁丽娟，郭子右，刘玉娟，李鑫，梅凯，李婷婷，吴清（北京中医药大学中药学院，北京102488）

丹骨方由丹参、骨碎补等药材组成，其临床剂型为汤剂，对骨质疏松的防治疗效好，然而汤剂存在服用口感差，服用量大，难以保存、运输等问题[1]，限制了其推广生产。为了更好地服务于患者，本课题组拟改良丹骨方剂型。颗粒剂既保留了汤剂的综合疗效、易吸收、显效快的优势[2]，又具备了成药便于服用，易保存、携带的特点[3]。将丹骨方由汤剂改良为颗粒剂能保留疗效，易于服用，从而增加患者的服药依从性，更有利于大规模生产使用。

课题组前期已确定丹骨方的提取纯化工艺[4]，在进行成型工艺研究时发现目前颗粒剂成型工艺考察时多使用单因素试验形式考察[5]，评价指标仅采用成型率佐以吸湿率或休止角[6]，考察方法和评价指标均较简单和片面，忽略了不同辅料配比和工艺参数变化对颗粒中有效成分含量及不同物理性质的影响，无法全面控制颗粒剂质量。

为了全面提高颗粒剂成品质量，使颗粒剂的化学性质和物理性质在一定程度上达到最优，本试验选择化学指标结合物理指标，使用三个试验设计（design of experiment，DOE）方法：D-optimal试验进行最优混合辅料配比考察；Plackett-Burman试验从所有变量中筛选出关键因素；Box-Behnken试验对筛选出的重要因素进行参数优化。对DOE评价指标进行方差分析，确定有显著差异的关键评价指标，剔除无显著差异的评价指标，将有显著差异的关键评价指标进行标准化，对标准化后的数据进行综合评分，使用Design-Expert 软件对各综合评分进行模型拟合与分析，得到最优辅料配比、关键因素和最优参数，最终优选出丹骨颗粒的最佳成型工艺，获得安全有效、均一稳定的颗粒剂成品。

1 材料

DT-1001A型电子天平（金羊天平仪器厂）；BZF50型真空干燥箱（上海博讯公司）；FW-200型高速万能粉碎机（北京科伟永兴一起有限公司）；药典筛（浙江上虞市纱筛厂）；Ultimate 3000高效液相色谱仪（VWD-3100紫外检测器、美国赛默飞公司）；Agilent zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国安捷伦公司）；KQ-300V DE双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

丹参（批号：181108002）、烫骨碎补（批号：181129006）[北京仟草中药饮片有限公司，由北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根茎及水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm.的干燥根茎；炮制品均符合《中国药典》2020年版标准]；可溶性淀粉（批号：20160817，天津市福晨化学试剂厂）；无水乳糖（批号：20170803，镇江市康福生物工程有限公司）；糊精（批号：180817，安徽山河药用辅料股份有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，Merck公司）；95%药用乙醇；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 丹骨药粉的制备

丹参、烫骨碎补等药材加水提取3次，每次12倍量，每次2 h，过滤，合并3次滤液，减压浓缩（60℃）至相对密度为1.05～1.10（60℃），再加入适量95%乙醇使含醇量达70%，搅匀，4℃以下冷藏24 h，滤过，回收乙醇，于真空干燥箱中干燥（60～70℃），干膏粉碎过80目筛，备用。取适量要求打粉的药材饮片置于高速万能粉碎机中，粉碎后过200目筛，收取过200目，不过300目筛的粉末，备用。将干浸膏与饮片原粉按处方比例混合均匀即得丹骨药粉。

2.2 多指标综合评分

2.2.1 评价指标 因丹酚酸B和丹参酮ⅡA为丹骨颗粒中主要有效成分，因此选择丹酚酸B保留率和丹参酮ⅡA保留率作为丹骨颗粒化学成分指标，与成型率、相对均齐度指数、吸湿率、干燥失重率、休止角、豪斯纳比、松密度及振实密度这些物理指标共同作为后续试验的评价指标[4，7]。由预试验可知，成型率、丹酚酸B保留率和丹参酮ⅡA保留率属于正向指标；代表均一性的相对均齐度指数，代表堆积性的松密度和振实密度也属于正向指标；代表稳定性的吸湿率和干燥失重率，代表流动性的休止角和豪斯纳比则属于负向指标。

2.2.2 综合评分 采用Design-Expert软件分别对各评价指标结果进行方差分析，剔除方差分析中差异无统计学意义的评价指标，采用最小-最大标准化法对剩余评价指标进行数据标准化处理，以解决数据同趋化和量纲问题，然后对标准化处理后的数据采用等权法进行赋权，使用加权求和得到综合评分，以综合评分为最终评价指标进行模型拟合及分析预测。

2.3 D-optimal试验考察混合辅料配比

前期研究发现单一辅料并不能完全满足生产要求，故本试验首先使用D-optimal试验设计进行混合辅料配比考察。综合前期单因素考察结果，选择可溶性淀粉、无水乳糖和糊精占辅料总量的百分比作为筛选因素，混合辅料优选范围为：无水乳糖20%～80%；可溶性淀粉0～60%；糊精0～60%。根据D-optimal拟合模型回归系数的方差最小化，回归模型预测精度最高的原则，选取3个因素进行D-optimal设计，试验安排及综合评分结果见表1。根据前期试验结果，暂按1∶1的比例称取丹骨方药粉与辅料，并过80目筛混合均匀，以95%乙醇为润湿剂制备软材，过18目筛制粒，于60℃干燥1.5 h后整粒，并测定各评价指标的值。通过软件分析和预测得到最优混合辅料比例。

表1 D-optimal试验设计安排及综合评分结果Tab 1 D-optimal test design and comprehensive score

D-optimal试验各评价指标结果见表2，方差分析结果见表3。由表3可知，可溶性淀粉、无水乳糖和糊精三者以不同的比例混合，对成型率、振实密度和豪斯纳比有显著差异（P＜0.05），对其余指标则无明显差异。因此成型率赋权为0.5，振实密度和豪斯纳比赋权各0.25。D-optimal试验综合评分＝0.5×成型率＋0.25×振实密度＋0.25×豪斯纳比，综合评分结果见表1。

表2 D-optimal试验各评价指标结果Tab 2 Evaluation index of D-optimal test

表3 D-optimal试验各评价指标方差分析结果Tab 3 Variance analysis of D-optimal test

对综合评分结果进行模型拟合，得模型拟合方程为Y＝0.3938A＋0.4949B－0.3466C＋2.4698AC＋2.2984BC，其中A、B、C分别表示乳糖、糊精、可溶性淀粉。对模型回归方程进行方差分析，结果表明所建立的数学模型具有显著性（P＜0.05），且A、B与C之间具有相互作用。三因素对综合评分影响的曲线图见图1。

图1 三因素对综合评分影响的曲线图Fig 1 Curve of the effect of 3 factors on the comprehensive score

综合评分曲线图中间基准值均为：A＝0.467，B＝0.267，C＝0.267。

由图1可知，C对综合评分影响最大。在基准值之下，A、B变化平缓，影响不大，随着数值的增大，C对综合评分成正相关，数值越大，评分越大，且变动剧烈，但是A、B比C的评分更高，并且A略高于B；在基准值之上，A、B对综合评分成负相关，数值越大，评分越低，且A比B的趋势更快，C则呈弧线趋势，随着数值的增大，综合评分先增高后降低，变化迅速。可见对于取值越大越好的综合评分，可溶性淀粉、乳糖及糊精在处方中的比例都不是越大越好，而是在一定范围内以一定的比例组合才能达到最优。

用软件的最优功能，设定综合评分的理想响应值为最大值，得到预测的最优组合为乳糖-糊精-可溶性淀粉（0.200∶0.476∶0.324），综合评分预测值为0.72。为了检验模型的可靠性以及软件设计给出的最优组合的预测值与实际值的差异，根据所得到的最优组合制备3批样品进行验证，所得验证结果各评价指标RSD均＜3%，偏差均＜5%。验证试验结果表明各评价指标实测值与预测值结果相近，说明软件预测的模型可靠，预测得到的丹骨颗粒的最佳辅料配比乳糖-糊精-可溶性淀粉（0.200 : 0.476 : 0.324）合理可信。

2.4 Plackett-Burman试验筛选成型工艺重要影响因素

根据预试验筛选因素水平范围，所有因素设置最低值（－1级）和最高值（＋1级）（编码信息如表4所示），固定95%乙醇为润湿剂。根据一级方程式（方程1[8]）设计了四因素二水平的Plackett-Burman试验，试验设计见表5。通过软件分析试验结果筛选得到关键因素。Y＝β0＋∑βiXi（其中Y是相应结果，β0是模型截距，βi是线性系数，Xi是独立变量的水平）。

表4 Plackett-Burman试验设计及综合评分结果Tab 4 Plackett-Burman test and comprehensive score

本部分试验评价指标结果见表6，方差分析结果见表7。由表7可知药辅比、润湿剂用量、干燥温度、干燥时间对豪斯纳比、丹酚酸B保留率、丹参酮ⅡA保留率不具有显著差异（P＞0.05），其余指标差异均具统计学意义（P＜0.01）。故权重系数分别为成型率0.2、相对均齐度指数0.2、松密度0.1、振实密度0.1、休止角0.2、吸湿率0.1、干燥失重率0.1。Plackett-Burman试验综合评分＝0.2×成型率＋0.2×相对均齐度指数＋0.1×松密度＋0.1×振实密度＋0.2×休止角＋0.1×吸湿率＋0.1×干燥失重率，结果见表5。

表5 Plackett-Burman试验设计因素水平Tab 5 Factor and level of Plackett-Burman trial design

表6 Plackett-Burman试验各评价指标结果Tab 6 Evaluation index of Plackett-Burman test

表7 Plackett-Burman试验各评价指标方差分析结果Tab 7 Variance analysis of Plackett-Burman test

对综合评分结果进行模型拟合，得模型拟合方程为Y＝0.4967＋0.03A＋0.07B＋0.083 33C＋0.025D，其中A、B、C、D分别代表药辅比、润湿剂用量、干燥温度和干燥时间。对模型回归方程进行方差分析，P值小于0.01，表明所建立的回归方程具有统计学意义，同时也表明所建立的数学模型具有较好的拟合度，可用于成型工艺优化过程中对关键工艺参数的筛选。影响因素的柏拉图见图2。

从图2可看出影响丹骨颗粒成型工艺综合得分的4个因素为干燥温度（C）＞润湿剂用量（B）＞药辅比（A）＞干燥时间（D）。4个因素对综合评分均有正影响，其中干燥温度和润湿剂用量对综合评分结果影响最大（P＜0.01）。虽然药辅比在本次试验中没有显著影响，但是在大生产时药辅比是重要的影响因素，且药辅比对服用剂量的影响较大，因此选择干燥温度、润湿剂用量和药辅比进行后续Box-Behnken试验设计研究。由图2可得干燥时间对综合评分成正相关，因此固定为高水平，即120 min。

图2 Plackett-Burman试验因素柏拉图Fig 2 Pareto of factors of Plackett-Burman test

2.5 Box-Behnken试验设计优化重要影响因素参数值

Box-Behnken试验利用多元二次回归方程（方程2[9]）拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析能找到最优工艺参数区间。以Plackett-Burman试验结果为考察因素，每个因素选择3个水平，进行三因素三水平Box-Behnken试验，组成了17个试验组，因素水平及编码见表8，试验设计及综合评分结果见表9。通过软件分析结果得到最佳参数值。Y＝a0＋∑aixi＋∑aiixi2＋∑aijxixj（其中Y为预测值；a0、ai、aii和aij是模型的常数回归系数；xi和xj（i＝1～3；j＝1～3；i≠j）以编码值的形式表示自变量。

表8 Box-Behnken试验设计的因素及水平Tab 8 Factor and level of Box-Behnken test design

评价指标结果见表10，方差分析结果见表11。由表11可知，药辅比、润湿剂用量及干燥温度三因素对颗粒的成型率、相对均齐度指数、干燥失重率、松密度、振实密度、吸湿率有显著影响（P＜0.01、P＜0.05），对其余指标均不具有显著差异（P＞0.05）。以上结果说明成型环节三因素主要影响颗粒的成型率、均一性、堆积性及稳定性，而对颗粒的化学性质及流动性无明显影响。4个一级指标权重系数各为0.25，故各二级指标权重系数分别为成型率0.25、吸湿率0.125、干燥失重率0.125、松密度0.125、振实密度0.125、相对均齐度指数0.25。Box-Behnken试验综合评分＝0.25×成型率＋0.125×吸湿率＋0.125×干燥失重率＋0.125×松密度＋0.125×振实密度＋0.25×相对均齐度指数，综合评分结果见表9。

表9 Box-Behnken试验安排及综合评分结果Tab 9 Arrangement and comprehensive scoring of Box-Behnken test

表10 Box-Behnken试验各评价指标结果Tab 10 Evaluation index of Box-Behnken test

表11 Box-Behnken试验各评价指标方差分析结果Tab 11 Variance analysis of Box-Behnken test

对综合评分结果进行模型拟合，得模型拟合方程为Y＝0.44－0.012A＋0.24B＋0.038C－0.025AB－0.047AC＋0.013BC－0.014A2＋0.074B2，其中A、B、C分别表示药辅比、润湿剂用量及干燥温度。对模型回归方程进行方差分析，P值小于0.01，表明所建立的回归方程具有显著性；模型决定系数R2＝0.9382，调整系数＝0.8587，表明模型具有较好的预测性；失拟项P＞0.05，表明试验不存在失拟因素，所选因素合理。

在实际生产过程中，要制备到成型率高，物理化学性质均较好的颗粒，因此设定综合评分的目标值为最大值，采用Design-Expert 11软件中Numerical功能得到的最佳成型工艺参数条件为药辅比用量为1∶1.73，润湿剂用量为40%，干燥温度为60℃。按优选出的工艺条件进行3批验证试验，所得验证结果各评价指标RSD均＜3%，偏差均＜5%。验证试验结果表明各评价指标实测值与预测值结果相近，说明软件预测的模型可靠，可用于优化丹骨颗粒的成型工艺参数。

4 讨论

丹骨方提取制得的浸膏粉中含有大量多糖和皂苷类成分，因此极易吸湿，药粉吸湿后会发生潮解、聚集、结块等现象[10]，使流动性降低，不利于制剂的稳定[11]。前期吸湿性考察发现，方中的饮片原粉能够改善药粉吸湿性，表明其可代替一部分辅料，从而降低辅料用量，减少服用量，因此后续考察成型工艺条件时首先将饮片原粉与浸膏粉按处方量混合均匀作为原材料药粉，避免影响试验结果。

根据前期稀释剂筛选试验，发现可溶性淀粉成型率最好，但是抗吸湿能力和流动性较差；乳糖流动性和抗吸湿性能力最好，但是成型率一般且价格昂贵；糊精各项指标平均但廉价易得。由于单一辅料无法完全满足药剂工艺生产要求，为了获得更好的性能，后续选择研究混合辅料配比[12]。

Box-Behnken试验发现药辅比的改变对结果影响不显著，与Plackett-Burman试验设计筛选结果一致。推测是因为药粉中的饮片原粉替代了部分辅料的作用，维持了整体处方的平衡，因此药辅比在1∶0.5～1∶2内均处于相对稳定的状态。

为了快速高效地获得多指标综合评价分高的固体制剂，本试验采用DOE方法对成型工艺部分进行优化。因DOE方法能够以最少的时间和成本投入，换取最大的收益，从而提升产品质量，优化工艺流程[13]的特点已广泛运用于冶金[14]、电子[15]、汽车[16]、医疗[17]等多个领域。试验结果证明多指标综合评价法结合DOE方法能够快速有效地优化颗粒剂成型工艺，为获得高成型率，化学指标性成分保留率高，物理属性均一稳定的颗粒剂提供指导和参考。