基于正交试验和主成分分析法考察壁虎的最佳烘制工艺

宋肖桦，张荳，胡慧华（北京中医药大学中药学院，北京 102488）

壁虎为壁虎科动物无蹼壁虎（Gekkos swinhonisGuenther）、多疣壁虎（G.japonicusDumerilet Biron）或蹼趾壁虎（G.subpalmatusGuenther）的干燥全体，性寒，味咸，有小毒[1]，主治中风瘫痪、手足不举、历节风痛、风痉惊痫、小儿疳痢、疬风瘰疬、血积成痞、疗蝎螯等[2]。现代临床研究发现，壁虎具有祛风定惊、散结解毒、止咳平喘的作用[3]。药理研究发现，壁虎治疗恶性肿瘤、骨髓炎等疾病作用显著，引起了医药界的关注[4]。中药壁虎未载入2020年版《中国药典》，也没有统一规范壁虎的炮制工艺。为保证临床用药的准确性，本文通过正交试验法对壁虎的烘制温度、铺药厚度、烘制时间进行考察，并且采用主成分分析法对壁虎的外观性状（硬度、黏附性、咀嚼性、颜色）、常规检查项目（水分、水溶性浸出物）和物质基础（蛋白质、多糖、粗脂）数据进行分析，得到壁虎烘制的最优工艺，以期为壁虎的炮制研究提供可靠的理论参考和数据支撑。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-P7型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；FA1104B型电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；SB25-12DTD型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；101-2AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；HC-300T型固体粉碎机（永康市天祺盛世工贸有限公司）；CM-5型分光测色仪（日本柯尼卡美能达公司）；TMS-Pro型质构仪（美国FTC公司）。

1.2 试药

石油醚（批号：20190819，国药集团化学试剂有限公司）。壁虎生品产自安徽，经北京中医药大学胡慧华副教授鉴定为壁虎科动物无蹼壁虎（Gekkos swinhonisGuenther）的干燥全体。

2 方法

2.1 壁虎烘制工艺的正交试验设计

壁虎的具体炮制参数，如烘制温度、铺药厚度、烘制时间等，药典中并未作规定，现行的各省市中药饮片炮制规范对壁虎的规定亦不统一。本课题组前期就壁虎的具体炮制工艺参数进行了单因素考察，最终选择烘制温度、铺药厚度、烘制时间这三个因素来考察壁虎的烘制工艺。采用L9（34）正交设计，各因素水平见表1，试验条件见表2。

表1 壁虎烘制工艺因素水平Tab 1 Factor and level of gecko baking process

表2 壁虎烘制工艺试验条件Tab 2 Test conditions of gecko baking process

2.2 壁虎不同烘制品的制备

取大小均匀的生壁虎适量，置白色搪瓷盘（30 cm×20 cm）内，按照正交试验条件烘箱烘制一定时间，取出，放凉备用。

2.3 水分测定

按照2020年版《中国药典》第四部通则0831干燥失重测定法测定水分[5]。精密量取供试品粉末2.5 g，平铺于干燥至恒重的扁型称量瓶中，厚度不超过5 mm，精密称定，在105℃干燥5 h，移置干燥器中，放冷，精密称定，于105℃干燥1 h，放冷，称重，至连续两次称重的差异不超过5 mg为止。根据失重计算供试品中含水量（%），平行测定3次。

2.4 水溶性浸出物

按照2020年版《中国药典》第四部通则2201浸出物测定法进行浸出物测定[5]。精密称定供试品4 g，置锥形瓶中，精密加水100 mL，称重，静置1 h，加热回流至沸腾，保持微沸1 h，放冷，称重，用水补足失重，过滤，精密移取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中蒸干，于105℃干燥3 h，放冷，迅速精密称重，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量（%），平行测定3次。

2.5 色度测定

测定条件：D65光源，10度视角，8 mm测定口径，SpectraMagicNx软件进行数据处理，获得L*值、a*值及b*值（L*代表亮度，值越大，亮度越大；a*代表红绿相，正值表示红色，负值表示绿色；b*代表黄蓝相，正值表示黄色，负值表示蓝色）[6]。取供试品，粉碎过四号筛，混匀，装入测色皿中适量，平行测定3次。

2.6 粗脂测定

取供试品，粉碎过四号筛，混匀，精密称定，干燥12 h，索氏提取10 h。待药渣挥干后精密称定，根据减重计算供试品中的粗脂含量（%），平行测定3次。

2.7 质地测定

质构仪测定最大测量量程：1000 N，形变量：50%，测试速度：60 mm·min－1，最小感应力：15 N，间隔：2 s。测定壁虎样品的硬度（N）、黏附性（N.sec）和咀嚼性（N），平行测定3次。

2.8 蛋白质测定

取供试品，粉碎过四号筛，干燥12 h，索氏提取10 h。回收药渣，称取适量干燥粉末，按照课题组前期筛选得到的水溶性蛋白最佳提取工艺[7]，以去离子水（pH为6.8）为提取溶剂，料液比为1∶70，提取时间为84 min，pH为14，采用超声提取法测定生壁虎中蛋白质的含量，平行测定3次。

2.9 多糖测定

取供试品，粉碎过四号筛，干燥12 h，索氏提取10 h。回收药渣，称取适量干燥粉末，按照课题组前期筛选得到的多糖最佳提取工艺[8]，以去离子水为提取溶剂，超声提取时间为80 min，料液比为1∶60，80%乙醇沉淀，采用水提醇沉法测定生壁虎中多糖的含量，平行测定3次。

3 结果

3.1 壁虎烘制样品的含量测定

生品和不同烘制条件下所得壁虎样品指标成分的含量见表3。

表3 不同烘制条件下壁虎指标性成分含量结果(±s，n＝3)Tab 3 Content of index components in gecko under different baking conditions (±s，n＝3)

表3 不同烘制条件下壁虎指标性成分含量结果(±s，n＝3)Tab 3 Content of index components in gecko under different baking conditions (±s，n＝3)

物/%L*a*b*粗脂/%硬度/N黏附性/组别水分/%水溶性浸出（N.sec）咀嚼性/N蛋白质含量/（mg·g－1）多糖含量/（mg·g－1）16.88±0.059.45±0.0354.21±0.264.22±0.0219.88±1.0814.24±0.5180.39±2.740.14±0.091.57±0.07131.61±0.880.73±0.01 26.54±0.025.72±0.0157.45±0.523.72±0.0120.00±0.4015.67±0.1225.25±4.230.09±0.000.03±0.04130.63±0.370.60±0.01 36.68±0.027.04±0.0255.48±1.544.23±0.0620.33±0.2513.38±0.3775.46±3.590.04±0.001.63±0.00135.14±0.051.30±0.02 46.21±0.016.32±0.0755.59±0.803.85±0.0520.24±0.8912.80±0.3155.14±1.360.01±0.001.47±0.01131.93±0.050.86±0.01 55.62±0.026.03±0.0456.04±0.433.41±0.0720.29±0.3113.80±0.6834.52±3.890.13±0.020.10±0.23130.29±0.140.91±0.03 65.97±0.066.11±0.0255.92±1.404.51±0.1621.93±1.5816.32±0.1558.88±0.540.20±0.010.55±0.12131.34±0.121.06±0.01 75.12±0.076.33±0.0453.03±2.705.30±0.0921.50±1.3314.29±0.3323.16±1.210.17±0.04－0.07±0.00132.94±0.941.02±0.04 85.44±0.067.15±0.0253.20±0.984.19±0.0520.13±0.7916.34±0.7420.32±1.210.39±0.040.21±0.00131.46±0.161.07±0.03 94.70±0.049.10±0.0452.24±0.895.35±0.2421.20±1.5514.66±0.2912.70±0.630.08±0.060.37±0.00133.41±0.331.02±0.04生品7.14±0.056.29±0.0457.50±1.034.03±0.1921.01±1.0812.76±0.5588.76±1.220.05±0.010.16±0.09132.51±0.750.77±0.01

3.2 壁虎烘制工艺优选的主成分分析

本试验测定了与壁虎烘制有关的11个理化指标，不同烘制条件之间各指标值具有不同程度的差异。由于不同指标具有不同程度的量纲及数量级，并且存在正负相关性，为了消除对结果的影响，在数据分析前要先对原始数据进行极差标准化处理[9]。标准化数据通过SPSS 25进行主成分分析得到碎石图、相关性矩阵表和方差贡献分析表分别如图1、表4和表5所示。由表4可知，相关性矩阵中大部分数据大于0.3，说明数据具有相关性。

表4 壁虎各理化指标相关性矩阵表Tab 4 Correlation matrix of physical and chemical index for gecko

图1 壁虎烘制工艺优选的主成分分析碎石图Fig 1 Scree plot of principal component analysis of gecko baking process

表5 壁虎烘制方差分析贡献表Tab 5 Variance contribution of gecko baking

由图1可知，前4个主成分特征值均大于1，且从第5个主成分开始，特征值变化趋势逐渐平缓，因前4个主成分已经包含了11个指标的主要信息，可以用前4个主成分来评价壁虎的烘制工艺[10]。

由表5可知，前4个主成分的特征值分别为4.204、2.498、1.723、1.198，方差贡献率分别为38.219、22.707、15.668、10.887，表明前4个主成分分别可以反映壁虎样本38.219%、22.707%、15.668%、10.887%的信息量，累积贡献率达到87.481%，根据主成分理论分析，若前n个主成分的累积贡献率达到85%，则这n个主成分即可反映足够信息的原则[11]，因此可采用前4个主成分代替11个指标来评价壁虎的烘制工艺，这4个主分量基本保留了原有变量的全部信息，结果与图1相同。

由表6可以看出第一主成分以色泽红绿参数a*（0.893）的影响为主，水分（0.869）和黄蓝参数b*（0.778）的影响为辅；第二主成分以蛋白质（0.940）的影响为主，水溶性浸出物（0.790）和多糖（0.726）的影响为辅；第三主成分以脆度（0.843）的影响为主，以咀嚼性（0.629）的影响为辅；第四主成分以粗脂（0.853）影响为主，以黏附性（0.526）的影响为辅。通过各成分的贡献率可知，在烘制过程中，壁虎的色泽、水溶性蛋白质、粗脂和质地这4个指标变化较显著。

表6 壁虎烘制成分矩阵表Tab 6 Composition matrix for gecko baking

以特征向量为主成分的矩阵数据除以SQR主成分的特征值，可得到4个主成分表达式的系数。具体计算方法以第一主成分表达式为例，将表6中第一主成分的数据输入SPSS 25的数据编辑窗口（X1），点击“转换 → 计算变量”，在对话框中输入表达式“A1＝X1/SQR（4.204）”，即可得到特征向量，即第一主成分表达式的系数A1。其余3个主成分系数的计算方法与第一主成分系数的计算方法相同，结果见表7。将得到的特征向量与标准化数据相乘，即可得到主成分表达式[12]。

表7 壁虎烘制特征向量表Tab 7 Feature vector for gecko baking

F1（第1主成分）＝0.2278Z－多糖＋（－0.0005Z）－蛋白质＋0.4238Z－水分＋0.0536Z－水溶性浸出物＋（－0.3887Z）－L*＋0.4355Z－a*＋0.3794Z－b*＋0.2502Z－脆度＋（－0.2980Z）－黏附性＋0.2999Z－咀嚼性＋0.1985Z－粗脂

F2（第2主成分）、F3（第3主成分）、F4（第4主成分）的计算如F1所示。

根据计算公式F＝0.3822F1＋0.2271F2＋0.1567F3＋0.1089F4，可得出壁虎烘制品的主成分得分[13]，即不同烘制条件下多个指标的综合得分，并进行排序，结果见表8。根据综合得分的排序，可以看到不同条件下壁虎烘制品的品质差异，第9组的综合得分值最高，即A3B3C2，此条件的工艺参数为烘箱温度100℃，铺药厚度3 cm，烘制时间70 min。

表8 主成分得分表Tab 8 Principal component score

3.3 正交试验方差分析

以得到的主成分综合得分为指标进行正交试验，结果见表9及表10。

表9 壁虎烘制正交试验结果Tab 9 Orthogonal test of gecko baking

表10 壁虎烘制正交试验方差分析结果Tab 10 Variance of orthogonal test of gecko baking

通过表10方差分析结果可知，3个因素对壁虎烘制品的影响主次顺序为烘制温度（A）＞烘制时间（C）＞铺药厚度（B），烘制温度对壁虎烘制工艺有显著影响。根据表9正交试验，以及主成分综合得分越高越好的原则，对烘制温度进行分析，确定烘制温度的最佳水平为A3，铺药厚度和烘制时间对主成分综合得分的影响较小，综合各因素选择B3、C2，因此最优水平组合为A3B3C2，分析结果与表8主成分分析结果相同。即最终确定的最佳烘制工艺为：取净壁虎，置于30 cm×20 cm的白色搪瓷盘内，铺药厚度为3 cm，设定烘箱温度为100℃，烘制70 min，取出，晾凉，即得。

3.4 工艺验证

按照上述所得的壁虎烘制最优工艺平行制备3份壁虎烘制品，测定指标性成分含量，按照“3.2”项下方法计算11种指标的主成分综合得分，结果见表11，计算得3份样品的主成分综合得分平均值为0.6139，RSD值为1.7%。说明该烘制工艺结果稳定，可以用于壁虎的烘制。

表11 验证试验结果Tab 11 Verification test

4 讨论与分析

现代常用烘焙法对壁虎生品进行炮制，可以矫臭去腥，减弱壁虎生品明显的腥臭味，并利用烘制后产生的焦香气，提高口服用药的适口性。本课题组前期试验发现，用锅来焙制壁虎时，温度很难控制，且焙制过程中，常会溢出油脂，造成壁虎成分的损失，同时还会产生大量浓烟。近年来有研究发现[14]，壁虎烘干未焙制品比焙制品抑制肿瘤的效果更好。因此本文采用烘法炮制壁虎生品。

有研究发现，动物类药材烘制温度过高会使蛋白质变性失活[15]，而动物类药材中含有的蛋白质和多肽是动物药的有效成分[16]，因此本试验选取的最高烘制温度为100℃。

采用质构仪进行壁虎的物性特性检测[17]，可以得到硬度、脆度、内聚力、黏附性和咀嚼性5组数据，但因为临床使用的壁虎多为研磨吞服，故只选用硬度、黏附性、咀嚼性3个指标进行壁虎的物性特性检测。

主成分分析法多用于多样本多指标的样本分析[18]。本文采用主成分分析法对壁虎的外观性状与内在指标进行了分析[19]，通过提取11个指标性成分的主成分因子，计算特征向量，得到主成分表达式，再通过累计贡献率原则，选择前4个主成分因子代替原有的11个主成分因子，建立壁虎烘制品的质量评价方法，通过主成分综合得分对正交试验结果进行排序，进而得到壁虎烘制的最佳工艺。

由于动物药成分复杂，选择单一成分作为壁虎烘制的优化指标，无法全面评价药物的内在品质[20-21]。因此，本文选择了物质基础（蛋白质、多糖、粗脂）、外观性状（硬度、黏附性、咀嚼性、颜色）和常规检查项目（水分、水溶性浸出物）等指标来评价壁虎的烘制工艺，进而得出壁虎烘制的较优工艺。