姜黄素对衰老相关骨质疏松小鼠骨代谢平衡的影响

吴文强，夏宸渝，谢鑫炎，李航，王娇娇，刘婷，屈健，黄松，鲁琼*（.广州中医药大学中药学院，广州 50006；.株洲人民医院药剂科，湖南 株洲 000；.中南大学湘雅二医院药学部，长沙 00；.长沙市中心医院内分泌科，长沙 000）

衰老相关性骨质疏松是老年人中常见的代谢性疾病，以骨量减少、骨微结构破坏和骨折风险增加为主要特征[1-2]。随着人口老龄化，骨质疏松症发病率日趋升高，严重危害人们的健康。衰老相关性骨质疏松以骨形成减少为主[3]，而临床治疗效果欠佳，如何促进骨形成亟待解决。目前治疗骨质疏松的一线药物如双膦酸盐类等，主要针对骨吸收增多所致的骨质疏松，而对骨形成减少所致的衰老相关性骨质疏松疗效欠佳[4-5]。而目前临床应用的促进骨形成的药物仅有特立帕肽，但因其长期使用会增加骨肿瘤的患病风险，因此推荐使用不超过2年[6]。为此，寻找安全有效的促骨形成药物对于衰老相关性骨质疏松的治疗至关重要。

姜黄素是从姜黄中提取得到的一种多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种药理活性[7-10]，对骨质疏松治疗具有潜在作用[11-13]。临床研究发现姜黄素联合阿仑膦酸盐可以改善绝经后骨质疏松妇女的骨密度[14]。骨髓间充质干细胞（BMSCs）可分化为成骨细胞、软骨细胞等[15]，成人随着年龄的增长，BMSCs的成骨分化潜能下降，导致成骨细胞分化数量减少，骨形成能力下降，从而导致骨质疏松的发生[3，16]。研究发现姜黄素可以促进体外BMSCs成骨分化[17]，而在体内的研究却不多见，因此，本研究着重于姜黄素在体内对衰老相关性骨质疏松中骨代谢平衡的影响。

1 材料

1.1 试药

姜黄素（批号：SLBN7214V，纯度≥65%，美国Sigma公司），橄榄油（批号：H28J10P91601，上海源叶生物科技有限公司），二甲基亚砜（DMSO）（广州捷倍斯生物科技有限公司），胎牛血清、α-MEM培养基（美国Biological Industries公司），茜素红S染液（赛业生物科技有限公司），抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸、H＆E染色试剂、TRAP染色试剂（美国Sigma公司），MTT试剂盒（碧云天公司），Liberase DL消化酶（瑞士Roche公司）。

1.2 仪器

mircoCT仪（Skyscan 1172，德国Bruker公司），石蜡切片机（microm HM325）、细胞培养箱（美国Thermo Fisher公司），酶标仪（瑞士Tecan公司）。

1.3 实验动物

24只健康的C57BL/6雄性小鼠，12月龄，质量为27～33 g；4只7日龄的C57BL/6小鼠[上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物使用许可证号：SYXK（湘）2015-0017]。所有动物饲养和实验方案由中南大学湘雅医学院实验动物研究中心动物伦理委员会审查并批准。

2 方法

2.1 细胞实验

2.1.1 原代BMSCs提取[18]取4只7日龄的小鼠股骨和胫骨，置于Liberase DL消化酶中，在37℃恒温水浴锅中消化。通过冷冻离心获得细胞悬液，补充1 mL完全培养基（含10%胎牛血清、100 U·mL－1青霉素、100 μg·mL－1链霉素的α-MEM培养基）。将细胞液种于培养皿中，每隔一日更换培养基，通过抗CD11b磁珠清除CD11b阳性的细胞，获得原代BMSCs。BMSCs培养条件为完全培养基培养，37℃，5%CO2的培养箱，2～3 d传代一次。

2.1.2 MTT检测细胞活性 细胞融合度为70%～80%时，消化离心，计数后将细胞接种在96孔板中，每孔大约2000个细胞，按照说明书方法，在培养箱孵育24 h后，用含有姜黄素的新鲜培养基替换旧培养基，孵育一段时间。然后在每孔中加入10 μL MTT液，再孵育4 h，最后加入100 μL DMSO溶解甲臜，当结晶完全溶解后在570 nm处测量吸光度。

2.1.3 成骨诱导实验 取生长良好的BMSCs，接种于6孔板。当细胞融合度达到40%～50%时，吸弃完全培养基，加入2 mL成骨诱导分化完全培养基[含有不同浓度的姜黄素（0、1、2 μmol·L－1）＋0.05 mmol·L－1抗坏血酸＋0.1 nmol·L－1地塞米松＋10 mmol·L－1β-甘油磷酸＋10%胎牛血清＋100 U·mL－1青霉素＋100 μg·mL－1链霉素的α-MEM培养基]。每隔3 d更换新鲜的成骨诱导分化完全培养基。诱导17 d后用2%茜素红S（pH＝4.2）染色。在显微镜下观察矿化情况并拍照记录。

2.2 动物实验

2.2.1 动物分组和给药方法 将C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、姜黄素组（50、100 mg·kg－1，用橄榄油溶解），每组8只，对照组灌胃橄榄油，实验组灌胃姜黄素，每日灌胃给药，连续给药3个月。

2.2.2 显微计算机断层扫描技术（microCT）给药3个月后，取小鼠股骨，用4%多聚甲醛固定24 h，然后使用microCT仪进行扫描。采用股骨远端的横断面图像进行股骨的三维组织形态计量学分析。在股骨远端，选择距生长板下方、股骨长度5%的区域作为分析的区域，用来确定单位组织体积中的骨小梁体积（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）。

2.2.3 苏木精-伊红（HE）染色 持续给药3个月后，取小鼠股骨，用10%福尔马林固定24 h，然后用10%乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙14 d，用石蜡包埋，切成厚度为4 μm的骨切片。切片采用二甲苯脱蜡与梯度乙醇脱水，苏木精染色5 min，水冲洗，伊红染色3 min，再次用水冲洗，乙醇进行脱水后自然晾干，二甲苯透明10 min，中性树胶封片，于显微镜下观察骨组织变化并拍照用来定量脂肪细胞。

2.2.4 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色 取小鼠股骨，用10%福尔马林固定24 h，脱钙包埋，切成厚度为4 μm的骨切片。梯度脱水后，TRAP染液37℃孵育1 h，然后加入0.02%苯酚磷酸盐缓冲液，孵育1 h。结束后，加入按照1∶1体积配制的4%亚硝酸钠溶液和5%副品红溶液中，常温反应20～30 min，然后流水冲洗，固定组织后完成TRAP染色，于显微镜下观察骨组织变化并拍照定量破骨细胞。

2.3 统计分析

所有数据均以均数±标准差（±s）表示，两两比较采用双尾的Student’st检验，多组间比较用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 姜黄素对BMSCs成骨分化的影响

MTT实验显示，与对照组相比，1 μmol·L－1姜黄素组的细胞存活率为（103.10±17.14）%，2 μmol·L－1姜黄素组的细胞存活率为（106.38±19.26）%，姜黄素对BMSCs活性没有影响（P＞0.05）。茜素红染色结果见图1，与对照组相比，姜黄素组的矿化结节数量增多，显示姜黄素对BMSCs有明显的促成骨作用。

图1 姜黄素对BMSCs成骨分化的影响（茜素红染色）Fig 1 Effect of curcumin on the osteogenic differentiation of BMSCs（alizarin red staining）

3.2 姜黄素对老年小鼠骨形成的影响

microCT扫描结果显示姜黄素可促进老年小鼠股骨的骨形成，见图2。采用CTan软件计算骨小梁参数，结果显示姜黄素使骨小梁的体积变大、数量变多、厚度变厚，骨小梁的分离度降低，见表1。说明姜黄素可以促进老年小鼠股骨的骨形成。

图2 姜黄素对股骨形态的影响（microCT）Fig 2 Effect of curcumin on the femoral morphology（microCT）

表1 姜黄素对股骨骨小梁的影响Tab 1 Effect of curcumin on femoral trabecular bone

3.3 姜黄素对老年小鼠骨组织的影响

HE染色结果显示，与对照组相比，姜黄素各剂量组骨组织增加，通过Image J 软件计数脂肪细胞数目，发现姜黄素可以使骨组织中每平方毫米的脂肪细胞数目（No.adipocytes/T.Ar）显著减少（P＜0.01），提示姜黄素可以缓解老年小鼠的骨质疏松症状，见图3。

图3 姜黄素对骨组织形态学的影响（HE染色，100×）Fig 3 Effect of curcumin on bone morphology（HE staining，100×）

3.4 姜黄素对老年小鼠破骨细胞的影响

TRAP染色见图4。与对照组相比，姜黄素各剂量组可以显著减少骨表面的破骨细胞数（Oc.N/BS）（P＜0.05，P＜0.01），说明姜黄素也影响小鼠破骨细胞的生成。

图4 姜黄素对破骨细胞的影响（TRAP染色，100×）Fig 4 Effect of curcumin on osteoclasts（TRAP staining，100×）

4 讨论

随着我国老龄人口占社会总人口的比例逐渐增大，与年龄相关的老年性骨质疏松成为重要的社会健康话题，寻找安全有效的药物来治疗老年性骨质疏松亟待解决。骨质疏松症在中医里属于“骨痿”的范畴，主要病因是脾肾虚引起的气血运行不畅、出现血瘀，可以采用补肾壮骨、健脾益气、活血通络的方法进行治疗[19]。姜黄是来自姜科植物姜黄Curcuma longaL.的干燥根茎，具有破血行气、通经止痛的功效，对骨质疏松具有潜在的疗效[20]。姜黄素是姜黄的主要成分，在体外具有促进成骨细胞生成[17，21]、抑制破骨细胞生成[22-23]的能力。姜黄作为药食两用的中药，其安全性较好，可以长期应用[7，24-25]。

4.1 骨质疏松模型的应用

常见的骨质疏松动物模型主要有绝经后骨质疏松模型和老年性骨质疏松模型，其中绝经后骨质疏松模型是通过对雌鼠进行去卵巢手术而制备的[26-28]；构建老年性骨质疏松模型的方法包括快速老化性骨质疏松动物模型[29]、D-半乳糖诱导引起的衰老性骨质疏松模[30]和自然衰老导致的骨质疏松模型[31]。目前姜黄素的研究较多侧重于对去卵巢大鼠的骨质影响[12，32]，而缺乏对于衰老相关的骨质疏松体内研究。由于BMSCs的成骨分化能力下降是发生老年性骨质疏松的重要原因[33]，本课题通过体外姜黄素干预BMSCs初步证实了姜黄素对老年性骨质疏松的潜在作用；在体内研究中，本研究通过自然衰老制备骨质疏松模型，研究姜黄素对老年性骨质疏松的作用。

4.2 姜黄素可以促进骨形成

骨质疏松早期没有明显的临床特征，很容易使患者错过最佳的治疗时机，而骨小梁数目、厚度等指标可以反应骨质疏松早期的骨流失[34]，因此对骨小梁的观察研究是防治骨质疏松是一种较好的手段。目前广泛应用于观察骨小梁结构的技术是microCT，它可通过三维图像重建骨小梁结构[35]，适用于骨质疏松的研究[36]。本研究通过microCT分析姜黄素对老年小鼠骨小梁的影响。与对照组相比，姜黄素组小鼠的骨小梁结构有所改善，这与姜黄素在其他骨质疏松模型的研究结论一致[12，37]，说明姜黄素确有改善骨质疏松症状的作用。为了进一步观察骨组织形态，本研究进行了H＆E染色，发现姜黄素可以增加骨组织、减少骨髓脂肪细胞的数量，表明了姜黄素可能对由年龄引起的骨质流失具有显著的保护作用，而目前多数临床用于骨质疏松的药物只影响骨吸收能力[4-5]，说明姜黄素具有治疗老年性骨质疏松的潜力。

4.3 姜黄素可以抑制骨吸收

在骨骼发生发展过程中，破骨细胞也起着重要作用，当破骨细胞数目较多时，也会引起骨质疏松[38]。为了观察姜黄素对老年小鼠破骨细胞的影响，本研究进行了TRAP染色，研究结果与体外研究一致[39]，姜黄素能够减少破骨细胞的数目，且在体内研究中也发现了类似的结论[40]。姜黄素不仅会影响老年性骨质疏松的骨吸收进程，还会影响其他类型骨质疏松的骨吸收过程，提示其可以应用于不同类型的骨质疏松治疗。

综上所述，本研究发现姜黄素既可促进老年小鼠的骨形成，还能抑制其骨吸收，同时在其他骨质疏松模型中发现姜黄素可以减少破骨细胞的数目，说明姜黄素有应用于不同类型骨质疏松治疗的潜能，但具体的作用机制尚未明确，未来可以研究姜黄素在骨形成和骨吸收方面的作用机制，并依据机制研究结论制备合适的剂型，在提高姜黄素生物利用度的同时使其适用于不同类型的骨质疏松，为骨质疏松提供新的治疗药物。