绵马贯众有效部位微丸的处方工艺优化及溶出特性研究

2021-07-03杨锦高增平尹兴斌曲昌海倪健北京中医药大学中药学院北京102488

中南药学 2021年6期

杨锦，高增平，尹兴斌，曲昌海，倪健（北京中医药大学中药学院，北京 102488）

绵马贯众为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨Dryopteris crassirhizomaNakai的干燥根茎和叶柄残基，味苦，性微寒，有小毒，归肝、胃经，具有清热解毒、驱虫的功效，常用于治疗时疫感冒、风热头痛、温毒发斑、疮疡肿毒、崩漏下血、虫积腹痛。现代研究中发现多个含有绵马贯众的中药复方被用于治疗流感，如双贯清感滴丸、连花清瘟胶囊和贯黄感冒颗粒等[1-4]。

绵马贯众中的有效成分绵马贯众素ABBA具有良好的抗流感病毒作用[5]，对感染流感病毒小鼠的保护率达90%。本课题组采用特殊提取工艺，对其有效成分进行富集，成功制得绵马贯众有效部位（GZP），主成分含量超过50%，同样具有良好的抗流感作用。但研究发现，GZP中大部分成分难溶于水，不利于药物的溶出和吸收。因此本文采用制剂学手段，采用一定技术对GZP进行处理后，再采用挤出滚圆技术制备成微丸增加药物的比表面积[6]；并通过单因素试验法结合Box-Behnken效应面法，以溶出度为评价指标，对微丸的处方进行优化，以期提高药物溶解度，增加药物的溶出。

1 仪器与试药

CML湿法制粒挤出滚圆一体机（caleva）；ZRS-8G智能溶出试验仪（天津精拓仪器科技有限公司）；ACQUITY I-CLASS ＆ PAD超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；SK7210HP KUDOS超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；METTLER TOLEDO万分之一分析天平、XS205 DualRang型分析天平（梅特勒-托利多国际贸易有限公司）。

吐温80（天津伦斯生物技术有限公司）；甲醇（色谱纯，Fisher公司）；甲酸（质谱纯，DikmaPure）；乙酸铵（分析纯，北京化工厂）；高纯水（Milli-Q超纯水系统制备）；0.22 μm 微孔滤膜（津腾公司）；聚维酮 K30（PVP K30）、微晶纤维素101（MCC 101）（安徽山河药用辅料股份有限公司）；淀粉、乳糖、交联聚维酮（PVP-P）、低取代羟丙纤维素（L-HPC）、交联羧甲基纤维素钠（CCMC-Na）（北京凤礼精求医药股份有限公司）；羧甲基淀粉钠（CMS-Na，西安天正药用辅料有限公司）；羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD，一鸣精细化工有限公司）；抗坏血酸、D-异抗坏血酸钠[石药集团维生药业（石家庄）有限公司]；磷酸二氢钾、氢氧化钠（分析纯，天津市光复科技发展有限公司）。

绵马贯众有效部位（自制，绵马贯众素ABBA含量为58.42%，批号：20201116）；绵马贯众素ABBA（自制，纯度为94.20%）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：含0.1%甲酸、10 mmol·L－1乙酸铵的甲醇（A）-含0.1%甲酸、10 mmol·L－1乙酸铵的水（B），梯度洗脱（0～3 min，80%～84%A；3～12 min，84%～89%A；12～13 min，89%～100%A；13～19 min，100%～80%A）；进样量：1 μL；流速：0.3 mL·min－1；检测波长：298 nm；柱温：40℃；样品室温度：25℃。

2.2 GZP微丸单因素考察

2.2.1 制备工艺因素考察微丸中最常用的成型促进剂为MCC[7-8]，本研究中采用MCC 101作填充剂，0.5% PVP K30水溶液为黏合剂，以微丸收率、休止角、丸条性状为评价指标，考察挤出速度（40、50、60、70 r·min－1）、滚圆速度（1200、1500、1800 r·min－1）、滚圆时间（3、5、7 min）对微丸成型的影响。结果表明，各挤出速度下微丸休止角均小于40°，说明微丸流动性满足要求，结合收率和生产效率选定挤出速度为60 r·min－1；当滚圆速度为1500 r·min－1时，微丸收率略高于其他组，且微丸粒径相对均一，因此选定1500 r·min－1作为滚圆速度；当滚圆时间为5 min和7 min时，微丸的粒径均较为均匀，但随着滚圆时间的延长，产生较多细粉，因此选定滚圆时间为5 min。

2.2.2 黏合剂浓度考察微丸成型预试验中发现采用MCC与乳糖混合制备微丸时，微丸成型性较好，因此设定药物与填充剂的比例为1∶3，填充剂中MCC的比例为66.67%，以收率、休止角、微丸外观为评价指标，考察PVP K30水溶液作黏合剂时[9]，其浓度对微丸成型的影响。结果显示，当黏合剂浓度为0.5%和1%时，收率和休止角无显著差异，说明黏合剂浓度对微丸成型无影响，因此根据微丸圆整度选定黏合剂为0.5% PVP K30水溶液。

2.2.3 崩解剂的种类和用量筛选在微丸制备过程加入适量崩解剂，可以有效提高微丸崩解速率，从而提高药物溶出速率[10-13]。固定崩解剂用量为5%，以微丸收率、休止角、微丸外观为评价指标，分别考察崩解剂CMS-Na、PVP-P、L-HPC、CCMC-Na对微丸成型的影响。结果显示，各组微丸收率均高于90%，休止角均小于30°，流动性良好，说明崩解剂的种类对于微丸成型无影响，结合药物性质选用CMS-Na为崩解剂。分别制备CMS-Na用量为1%、5%和8%的微丸，置于37℃、100 r·min－1和900 mL含5%吐温80的水溶液中，以微丸崩解时间为指标，考察崩解剂的用量。结果显示，崩解剂用量对微丸崩解时间有显著影响，当崩解剂用量为5%和8%时崩解时间差异不明显，因此选定崩解剂用量为5%。

2.2.4 填充剂中MCC的比例考察 MCC作为骨架材料显著影响微丸后期释药速率，且乳糖作为致孔剂，能够显著提高释药速率[14]。因此选用MCC与乳糖为填充剂，以45 min时微丸的溶出度为评价指标，考察填充剂中MCC的比例为66.67%、50.00%、33.33%、20.00%时对微丸溶出度的影响。结果显示，随着MCC比例的降低，溶出度逐渐提高，但当MCC比例继续降低时微丸成型较差，因此初步确定填充剂中MCC的比例可选择20%左右。

2.2.5 增溶方法考察参考文献[15-18]方法，考察HP-β-CD共研以及PEG 6000制备固体分散体对GZP的增溶效果。具体操作如下：

将HP-β-CD共混物（按质量比0.5∶1称取HP-β-CD与药物适量，混合均匀后于研钵中共研30 min）和固体分散体（称取3.00 g PEG 6000于80℃下水浴至熔融状态，逐量加入3.00 g GZP，搅拌均匀，迅速于－18℃下放置4 h，真空干燥过夜后，粉碎过80目筛）。按处方比例加入其他辅料，混合均匀后制备微丸，以45 min时微丸溶出度为评价指标，考察增溶方法。结果显示，HP-β-CD处理后的GZP微丸的溶出度超过50%，显著高于固体分散体组（27.14%），因此选用HPβ-CD共研法对药物进行预处理后，再制备微丸。

2.2.6 HP-β-CD与药物的比例考察参考文献[19-20]对HP-β-CD与药物的比例进行考察。称取适量HP-β-CD与药物混合均匀并共研30 min预处理后，按表1比例加入其他辅料制备微丸，其中1-1组和1-2组微丸均可成型，而1-3组微丸无法成型。

表1 微丸处方参数及微丸性状评价Tab 1 Pellet formulation parameters and character evaluation

分别称取1-1组和1-2组微丸，以45、90、180 min时累积溶出度为评价指标，选定较为适宜的微丸处方。结果表明，两组微丸溶出行为较为接近，且45 min时1-1组微丸溶出度超过50%，因此结合微丸性状选定1-1组为较优处方。

2.3 微丸溶出度的测定

2.3.1 溶出介质的选择根据前期试验结果，为保证达到漏槽条件，选择含5%吐温80的PBS溶液（pH＝6.8）作为溶出介质，考察1-1组微丸的溶出情况，结果发现微丸的溶出度在后期呈现明显的降低趋势。由于GZP中含有较多的间苯三酚类成分，推测可能是由于其酚羟基发生氧化反应从而降解，因此考虑在溶出介质中加入适量抗氧剂[21]。

以药物的稳定效果为评价指标，对抗氧剂的种类和用量进行筛选，主要考察煮沸和加入不同量的抗坏血酸、D-异抗坏血酸钠的抗氧化效果。以溶出介质为溶剂，配制一定浓度的药物溶液，并加入抗坏血酸（5 mg·mL－1）、D-异抗坏血酸钠（5、2、1 mg·mL－1），于37℃，100 r·min－1条件下恒温水浴振摇，分别于0 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h取样，续滤液进样，计算药物浓度。以时间为横坐标，测得浓度和0 min时药物浓度的比值为纵坐标绘制药物稳定性曲线图，结果见图1。2 mg·mL－1和5 mg·mL－1的D-异抗坏血酸钠对于药物的稳定效果较好，其中5 mg·mL－1组药物浓度相对更为平稳，因此选定抗氧化剂为5 mg·mL－1的D-异抗坏血酸钠。

图1 不同抗氧剂下的药物稳定性曲线图Fig 1 Stability curves of drugs with different antioxidants

2.3.2 溶出度的方法学研究

① 专属性考察：分别用溶出介质溶解对照品、样品和空白辅料，按“2.1”项下色谱条件，进样1 μL，记录色谱图，结果如图2所示，空白溶出介质和辅料对绵马贯众素ABBA的测定没有干扰。

图2 绵马贯众有效部位微丸UPLC色谱图Fig 2 UPLC chromatogram of pellets from effective parts of Dryopteris crassirhizoma Nakai

② 精密度考察：取绵马贯众素ABBA对照品适量，溶出介质溶解，连续进样6次，RSD小于3%，说明精密度良好。

③ 线性考察：精密称定绵马贯众素ABBA 6.36 mg于25 mL量瓶中，加入溶出介质超声至溶解，定容，逐级稀释配制成质量浓度分别为2.41、4.82、9.63、48.17、96.34、143.79、191.72、239.64 μg·mL－1的系列溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，以峰面积对质量浓度进行线性回归，得到线性回归方程为y＝8.112×103x－1.707×104（R2＝0.9996）。表明绵马贯众素ABBA在2.41～239.64 μg·mL－1内与峰面积线性良好。

④ 样品稳定性考察：称取适量样品，溶出介质溶解，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，保留时间和峰面积的RSD小于3%，说明样品在12 h内稳定性良好。

⑤ 回收率考察：精密称取样品约50%、80%、100%各3份，按处方比例加入空白辅料，溶出介质溶解，进样测定，计算回收率，低、中、高组的回收率平均值分别为97.25%、97.36%、95.90%，RSD均小于3%。

2.3.3 溶出度测定方法根据2020年版《中国药典》四部通则0931溶出度测定第二法（桨法），以900 mL含5%吐温80和5 mg·mL－1D-异抗坏血酸钠的PBS溶液（pH＝6.8）为溶出介质，溶出温度为（37±0.5）℃，转速为100 r·min－1，微丸投样量为0.3 g，分别于5 min、30 min时取样，并及时补加同温等体积溶出介质，0.22 μm微孔滤膜过滤，续滤液按“2.1”项下色谱条件进样，采用外标法以峰面积计算微丸累积溶出度。

2.4 Box-Behnken效应面法（BBD）优化微丸处方

2.4.1 因素水平表及试验结果根据单因素考察结果，分析GZP微丸制剂工艺的影响因素和各因素所取水平，固定药物与填充剂的比例为1∶3，黏合剂为0.5% PVP K30水溶液，挤出速度60 r·min－1，滚圆速度1500 r·min－1，滚圆时间5 min，选取HP-β-CD与药物的比例（A）、填充剂中MCC的比例（B）、CMS-Na用量（C）作为考察因素，结合BBD设计原理，每个因素设定3个水平，见表2，按BBD试验设计表进行试验，以5 min时累积溶出度（Y1）和30 min时累积溶出度（Y2）作为评价指标，试验设计表与结果见表3。

表2 因素水平Tab 2 Factor and level

2.4.2 模型拟合应用Design-Expert 8.0.5软件对表3中的数据进行处理，对各水平进行多元非线性回归，得到二项式拟合的方程分别为：Y1＝6.10＋10.39A－5.18B＋0.17C－7.55AB＋0.51AC－0.46BC＋10.76A2＋8.82B2－7.19C2；Y2＝19.95＋18.64A－6.26B＋1.05C－9.24AB＋1.52AC－1.24BC＋14.76A2＋11.96B2－8.57C2；Y1和Y2的回归方程的P值均小于0.05，说明其多元回归拟合模型成立。

表3 BBD试验设计与结果(n＝2)Tab 3 BBD test design and results (n＝2)

2.4.3 效应面优化与预测应用Design-Expert 8.0.5软件分别绘制Y1、Y2对两两因素的三维效应面图，直观描绘出各因素的影响，分别见图3。鉴于本研究的目的是提高药物的溶出度，因此在评价指标中，选择释放速度越快越好。故设定Y1（5 min时累积溶出度）的取值范围为50%～80%，以反映微丸的快速释放过程；Y2（30 min时累积溶出度）的取值范围为80%～100%，以反映微丸是否能够释放完全，将各效应面对应的等高线进行叠加绘制二维等高线叠加图，见图4，图中黄色区域为理想的较优区域，此时CMS-Na用量（C）固定为5%。

图3 各因素对Y1（A）及Y2（B）影响的三维效应面图Fig 3 Effect of each factor on Y1（A）and Y2（B）three-dimensional effect surface diagram

图4 处方优化的二维等高线叠加图Fig 4 Two-dimensional contour stacking diagram of prescription optimization

2.5 处方验证

根据试验优化结果，结合实际情况，选择上述优化区域中的处方，各因素为：HP-β-CD与药物比例（A）为0.70，填充剂中MCC比例（B）为18.50%，CMS-Na用量（C）为5%，进行微丸的制备，并分别测定微丸在5、30 min时累积溶出度，平行测定6组。结果如表4所示，Y1和Y2均满足试验预设取值范围，且RSD值均小于1%，说明该处方稳定合理。