慢性间歇性低氧模型大鼠的甲状腺功能分析

田 慧，高 隆，王泽辉

（1. 榆林市第一医院内分泌科，绥德 718000 ；2. 榆林市第一医院呼吸内科，榆林 719000；3. 延安大学医学院基础医学院，延安 716000）

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）是一种病因不明的睡眠呼吸疾病，临床表现为夜间睡眠打鼾伴呼吸暂停和白天嗜睡[1-2]。由于呼吸暂停引起反复发作的夜间低氧和高碳酸血症，可导致高血压、冠心病、糖尿病和脑血管疾病[3-4]，因此受到人们广泛关注。慢性间歇性低氧（chronic intermittent hypoxia, CIH）是OSAHS的主要病理特征，其表现为睡眠中反复出现低氧情况，而且它也是OSAHS导致心脑血管并发症的主要因素[5-6]。OSAHS和甲状腺功能减退症均为内科常见的疾病，它们在体征和症状方面有很多相似的临床表现，如：乏力、嗜睡、体质量增加、情绪低落等[7-8]。甲状腺、垂体等是高代谢器官，而OSAHS可造成组织缺氧，长此以往可能使这些组织器官（甲状腺、垂体）功能下降或异常[9]。因此，进一步明确OSAHS与甲状腺功能之间的关系显得尤为重要。本实验通过建立与OSAHS病理生理特征相似的CIH大鼠模型，检测各组大鼠血清中促甲状腺激素释放激素（thyrotropin releasing hormone，TRH）、促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）和甲状腺素（thyroxine，T4）的表达水平，同时观察各组大鼠甲状腺组织的病理变化和超微结构变化，探讨OSAHS与甲状腺功能之间的关系。

1 材料与方法

1.1 动物饲养

30只SPF级雄性SD大鼠，7周龄，体质量（200±20）g， 购自延安大学实验动物中心[SCXK（陕）2019-0014]。大鼠适应环境 [SYXK（陕）2019-0007] 2周后进行实验，动物实验经本单位动物福利伦理委员会批准（201902005）。

1.2 试剂和设备

TRH、TSH、T3和T4放射免疫分析试剂盒（北京北方生物技术研究所），HE染色试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司），甲苯胺蓝染色试剂盒（北京华威锐科化工有限公司），电子分析天平（日本SHIMADZU公司），光学显微镜和Leica 2065切片机（德国Leica公司），Hitachi-7500电子显微镜（日本Hitachi公司），γ-放射免疫分析仪（众成机电技术公司），动物低氧舱（上海塔望智能科技有限公司，型号：ProOx-810）。

1.3 动物分组和CIH模型制备

将30只SD大鼠随机分为对照（control）组、CIH组和复氧（reoxygenation，RH）组，每组10只。CIH组和RH组大鼠每日9∶00～17∶00放入低氧舱内。低氧舱内循环，先输入压缩空气30 s，后输入氮气30 s，以此循环[10]。实验过程中注意检测低氧舱内的氧浓度，使舱内氧浓度控制在体积分数8%～21%。实验过程中舱内产生的二氧化碳和水蒸气被生石灰和硅胶吸取。CIH组大鼠连续进行实验4周，其余时间均正常饮食饮水；RH组连续进行低氧舱实验4周后正常饲养4周（复氧），其余时间均正常饮食饮水；control组大鼠不予任何处理，正常饮食饮水4周。

1.4 大鼠灌注与取材

实验结束后，大鼠经腹腔麻醉后，将其四肢固定于解剖板上，并从颈静脉抽血约5 mL，于4 ℃以3 000 r/min 离心15 min，吸取上层血清（其中TRH采血管中预先加入TRH 抗灭活剂硫酸8-羟基喹啉、Tween-20和乙二胺四乙酸二钠），于－80 ℃冰箱保存。接着打开大鼠胸腔，由左心室插入静脉针头至升主动脉，剪开右心房，快速灌注4%多聚甲醛溶液，约30 min，至大鼠尾变硬。迅速解剖大鼠颈部肌肉，可看到甲状软骨和气管，在甲状软骨和气管环两侧可看到一对长椭圆形深红褐色组织，即甲状腺，轻轻摘除双侧甲状腺组织，用干纱布吸水后迅速置于电子天平上称重。甲状腺组织经戊二醛固定等步骤后制成切片，染色并摄影观察。

1.5 放射免疫分析

将－80 ℃冰箱中的血清置于冰上进行溶解，待其溶解后按照试剂盒上的说明书进行操作，计算血清中TRH、TSH、T3和T4的含量。

1.6 HE染色

将甲状腺组织用4%多聚甲醛溶液固定2～3h；然后对甲状腺组织进行包埋，并切成4 µm切片；切片放入苏木精染液中5 min，自来水清洗后，置于1%的盐酸乙醇溶液分化数秒，并用流水冲洗。切片放入伊红染液中染色3 min，流水清洗。之后切片置于梯度乙醇溶液（70%、80%、90%、100%）中脱水，各5min，再放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明，分别5min。将切片取出，用滤纸轻轻拭干切片上残余的二甲苯，在组织上滴加中性树胶封固，使用光学显微镜观察并摄影。

1.7 甲苯胺蓝染色

将甲状腺组织用4%多聚甲醛溶液固定2～3 h；然后对甲状腺组织进行包埋，并切成4 µm的切片；将切片用含30%乙醇的甲苯胺蓝溶液染色30 min；用无水乙醇洗10 min；中性树脂封固，光学显微镜下观察并摄影。

1.8 电子显微镜观察

将甲状腺组织用戊二醛溶液固定2～3 h，漂洗后用 l%锇酸溶液固定2 h，之后用丙酮溶液进行梯度脱水，甲状腺组织块包埋在电子显微镜标本模板中，置烤箱内加温烘干，并切成厚片或半薄切片。将切片转移到滴有蒸馏水的洁净载玻片上，展平，等待其干燥后，用甲苯胺蓝染剂染色，光学显微镜下定位，以确定观察区域。接着制作超薄切片，并将超薄切片转到有聚乙烯醇缩甲醛支持膜的铜载网上，将3%柠檬酸+0.1%醋酸铀染色液滴于石蜡板上，把贴有切片的铜网放在石蜡板上，染色15 min，清水洗净。使用Hitachi-7500电子显微镜摄影观察。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 CIH模型的鉴定

实验过程中，CIH组和RH组大鼠分别在低氧舱内氧最低浓度和氧最高浓度时，随机对CIH组和RH组大鼠进行血氧饱和度和动脉血气分析检测，其血氧饱和度为70%～92%，动脉氧分压为60.7～80.1 mmHg，接近OSAHS病理生理特点，提示CIH动物模型建立成功。

2.2 各组大鼠血清中TRH、TSH、T3和T4的含量

如表1所示，与control组比较，CIH组大鼠血清中TRH、TSH、T3和T4的表达水平明显降低（均P＜0.05）；与CIH组比较，RH组大鼠血清中TRH、TSH、T3和T4的表达水平明显升高（均P＜0.05）。

表 1 各组大鼠血清中TRH、TSH、T3和T4的含量Table 1 The serum levels of TRH, TSH, T3 and T4 in each group of rats( ± s, n=10)

表 1 各组大鼠血清中TRH、TSH、T3和T4的含量Table 1 The serum levels of TRH, TSH, T3 and T4 in each group of rats( ± s, n=10)

注：TRH为促甲状腺激素释放激素，TSH为促甲状腺激素，T3为三碘甲状腺原氨酸，T4为甲状腺素。Control为对照组，CIH为慢性间歇性低氧组，RH为复氧组。与control组比较，*P<0.05；与CIH组比较，#P<0.05。

-1-1-1-1 组别 TRH/(µg·L) TSH/(µg·L) T3/(µg·L) T4/(µg·L)Control CIH RH 37.67±2.45 24.56±1.87*32.45±1.56#2.22±0.56 1.45±0.31*1.98±0.35#1.25±0.47 0.66±0.07*1.22±0.32#85.78±3.24 57.67±2.54*78.95±2.38#

2.3 各组大鼠甲状腺质量变化

与control组大鼠甲状腺质量[（43.67±1.56）g]比较，CIH组[（71.78±1.67）g]明显增加（P＜0.01）；与CIH组大鼠甲状腺质量比较，RH组[（50.45±1.32）g]明显减轻（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠甲状腺组织的病理变化

HE染色结果（图1）显示，control组大鼠甲状腺组织含有均质嗜酸胶体的滤泡，并被具有中央核的简单立方嗜碱性滤泡细胞排列；CIH组大鼠甲状腺组织的正常滤泡结构丧失，其中胶体耗尽，一些滤泡细胞出现空泡，基核较暗；RH组大鼠甲状腺组织显示正常滤泡结构，但某些滤泡细胞仍呈空泡状，胶体出现了变化。

2.5 各组大鼠甲状腺组织中甲状腺滤泡的变化

甲苯胺蓝染色结果（图2）表明，control组大鼠甲状腺组织有完整的甲状腺滤泡，内衬滤泡细胞和轻滤泡旁细胞；CIH组大鼠甲状腺显示不规则甲状腺滤泡，腔内有脱落的滤泡和滤泡旁细胞；RH组大鼠甲状腺组织表现出完整的甲状腺滤泡结构，但有些滤泡细胞仍显示为空泡，并带有深色核。

图 1 HE染色观察各组大鼠甲状腺组织的病理变化（×100）Figure 1 HE staining to observe the pathological changes of thyroid tissue in each group of rats (×100)

图 2 甲苯胺蓝染色观察各组大鼠甲状腺的病理变化（×100）Figure 2 Toluidine blue staining to observe the pathological changes of thyroid in each group of rats (×100)

2.6 各组大鼠甲状腺组织超微结构的变化

电子显微镜检查结果（图3）表明，control组大鼠甲状腺具有正常的滤泡细胞，滤泡细胞中具有常染色体、完整的溶酶体和内质网；CIH组大鼠甲状腺滤泡细胞出现细胞核收缩，异染色质增加，基质损失，线粒体空泡，溶酶体和脂质滴增加；RH组大鼠甲状腺显示出或多或少完整的滤泡细胞结构，其中有常染色体、内质网和溶酶体。

图 3 电子显微镜观察各组大鼠甲状腺超微结构变化（×5 000）Figure 3 Electron microscopy observation of the ultrastructural changes of the thyroid gland in each group of rats(×5 000)

3 讨论

OSAHS是一种常见疾病，会导致呼吸中断，吸氧时间减少（呼吸暂停或呼吸不足），然后在患者入睡时迅速进行重新充氧[11]。氧气吸入的减少导致缺氧、高碳酸血症和胸腔内压力降低[12]。在OSAHS期间，反复的低氧血症和高碳酸血症可能会导致神经功能障碍，儿茶酚胺、内皮素和肾素-血管紧张素系统紊乱，内分泌功能障碍，以及血尿动力学改变[13]。OSASH与全身性疾病相关，包括高血压、高脂血症、冠状动脉疾病、自身免疫性疾病和癌症[14-15]。

甲状腺功能减退是由多种原因引起的，其机制是甲状腺激素合成及分泌减少，或其生理效应不足所致机体代谢降低；按其病因分为原发性甲状腺功能减退、继发性甲状腺功能减退及周围性甲状腺功能减退三类[16]。甲状腺功能的调节是复杂的神经内分泌调节过程，受多种因素的影响。内分泌系统直接由下丘脑调控，产生TRH，通过垂体门脉系统进入腺垂体，促使腺垂体释放TSH，TSH可使甲状腺释放T4和T3。其中腺垂体除受到下丘脑的调节外，还受到甲状腺激素的负反馈调节[17]。

研究发现，OSAHS患者血清中游离T3、游离T4水平均明显下降[18]。本实验结果表明，CIH组较control组的血清TRH、TSH、T3、T4水平降低，说明OSAHS可能会引起下丘脑受损，使TRH的分泌减少，从而使TSH（腺垂体分泌）的分泌减少，最终使T3和T4的分泌降低，引起甲状腺功能减退症状。熊俊伟[19]研究表明，CIH可引起大鼠甲状腺质量增加，去除缺氧因素后甲状腺质量基本恢复正常。本研究中也对大鼠甲状腺进行了称量，发现CIH组大鼠甲状腺质量明显增加，说明OSAHS对甲状腺是有损伤作用的。从HE染色、甲苯胺蓝染色和电子显微镜观察结果可知，CIH组大鼠甲状腺组织有一定程度的损伤；然而，进行4周复氧后RH组大鼠血清中TRH、TSH、T3、T4水平升高，甲状腺质量减轻，甲状腺组织的损伤程度减小。

综上所述，OSAHS对甲状腺有一定的损伤作用，但是复氧可以减轻其损伤，因此在临床上可以对OSAHS患者给予持续正压通气治疗。在本实验中没有对下丘脑和垂体进行深入的研究，因此OSAHS的病理机制还有待进一步研究。