从脑胃ghrelin通路探讨应激对大鼠食欲的影响

赵怡玲，高鹏飞，肖 茜，张 岚，潘丹青，徐月妹

（复旦大学附属金山医院中医科，上海 201508）

应激会引发一系列生理和行为反应，显著改变人类和动物的新陈代谢以及行为状态[1]。例如，大多数人在应激状态下摄食会发生变化，大约有40%的人会表现为吃得更多，40%的人摄食量会少于平时[2]。既往一项针对133名患有暴食症女性的调查发现，应激与暴食行为相关[3]。此外，基于人群的数据表明，应激状态会增加食物消耗量[4]。在一种束缚应激模型大鼠的研究中发现，应激也可以导致大鼠摄取诸如脂肪及糖类混合物等“舒适”食物的量增加[5]。

Ghrelin又称饥饿素或生长素，是一种由28个氨基酸组成的内源性脑肠肽，在1999年由日本科学家Kojima首先分离发现。Ghrelin是生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）的内源性配体[6]，主要由胃黏膜下层的X/A样细胞分泌，具有改善能量代谢等多种生理功能[7]。目前，ghrelin对食欲的调节作用越来越受到学者的关注。本研究观察应激对大鼠食欲的影响，并从脑胃ghrelin通路探讨应激影响大鼠食欲的具体机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

大鼠酰基化ghrelin检测用ELISA试剂盒（货号：#EZRGRA-90K）购自德国Merck公司；BCA蛋白定量试剂盒（货号：PICPI23223）购自德国Thermo公司；兔抗鼠ghrelin多克隆抗体（货号：ab129383）和兔抗鼠腺苷酸活化蛋白激酶α2（Amp-activated protein kinase α2，AMPKα2）多克隆抗体（货号：ab3760）购自英国Abcam公司；兔抗鼠GAPDH单克隆抗体（货号：#5174）购自美国CST公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（货号：A0208）购自上海碧云天生物技术研究所；RNA抽提试剂盒（货号：#K0223）购自德国Thermo公司；反转录试剂盒（货号：#K1622）购自加拿大Fermentas公司；实时荧光PCR试剂盒即qPCR SYBR Green PCR试剂盒（货号：11203ES08）购自翌圣生物科技（上海）有限公司；ghrelin、GHSR、瘦素（leptin）、AMPKα2、神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）和刺鼠基因相关蛋白（agouti-related protein，AgRP）引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

Real-time PCR仪为美国ABI公司产品（型号：ABI-7300）；低温冷冻离心机为上海卢湘仪离心机仪器有限公司产品（型号：TG-16M）；旋涡振荡器为青浦泸西仪器厂产品（型号：K30）；电动匀浆机为德国FLUKO公司产品（型号：PRO200）；电泳仪购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司（型号：Mini Protean 3 Cell）；电转仪为大连竞迈科技有限公司产品（型号：PS-9）；酶标仪为芬兰雷勃酶标仪（型号：MK3）；成像系统为上海天能科技有限公司产品（型号：Tanon-5200）。

1.2 实验动物与分组

选用32只SPF级雄性6周龄Wistar大鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[SCXK（沪）2013-0016]。大鼠饲养于复旦大学公共卫生临床中心动物实验中心[SYXK（沪）2015-0008]，环境维持在（21±1）℃，12/12h光照-黑暗周期，自由摄食与饮水。大鼠适应性饲养7 d后，按照随机数字表法分为对照组和应激组，每组16只，每2只大鼠置于一笼（45.5 cm×34.5 cm×20.0cm）。每周（即应激7、14和21d）记录一次大鼠的体质量，每天记录一次每笼大鼠的摄食量。在实验过程中，实验动物的饲养管理及使用均按照中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》执行，按照3R原则给予实验动物人道关怀。

1.3 应激造模方法

应激组大鼠采用夹尾激怒法建立应激模型，具体方式参照文献[8]的方法，并做出部分修改：将2只大鼠装于同一鼠笼内，用纱布包裹止血钳尖端后轻夹大鼠尾巴近段1/3处，每次刺激30 min，每天刺激2次，间隔3 h，连续21d；每次刺激后大鼠在笼内自由活动。造模过程中发现，夹尾刺激期间，大鼠被激惹，会尖叫，易与同笼大鼠打斗。对照组不进行其他干预。两组大鼠均给予普通饲料，自由摄食及饮水。

1.4 行为学观察

造模第1、7、21天，每组随机选取8只大鼠，观察其拒俘反应性。实验人员手戴全新的手套抓捕大鼠，观察大鼠的拒俘反应并记分。记分标准：很容易抓取动物，记0分；尖叫或回避，记1分；尖叫并回避，记2分；逃脱，记3分；逃脱并尖叫，记4分；咬或试图撕咬手套，记5分；主动跃起攻击，记6分。

1.5 ELISA法检测血清ghrelin水平

造模第7及第21天，每组随机取8只大鼠，用20%乌拉坦以5 mL/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠后，心脏采血，收集于4mL EDTA抗凝管中，以3 000 r/min转速离心15 min后，取上层血清，储存在－80℃冰箱中待检。已知ghrelin在血清中主要以高活性的酰基化和有限生物活性的去酰基化形式存在。因此，采用酰基化ghrelin的ELISA试剂盒测定大鼠血清中活性ghrelin蛋白水平。

1.6 蛋白质印迹法测定胃内ghrelin蛋白以及下丘脑组织内ghrelin和AMPKα2蛋白的表达

造模第7及第21天，每组随机取8只大鼠，按1.5节方法行心脏采血后，取脏器标本胃及下丘脑组织。取一份组织先充分裂解后抽提蛋白，然后使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。每孔按蛋白量25 µg上样，进行10% SDS-PAGE。电泳结束后，将凝胶上的蛋白条带转移至纤维素膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h或4 ℃过夜。分别加入按照1∶250稀释的ghrelin一抗、1∶2 000稀释的AMPKα2一抗和1∶2 000稀释的GAPDH一抗，4 ℃水平摇床上孵育过夜。TBST漂洗3次后，加入按照1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，与膜37 ℃孵育1 h。继续用TBST洗涤3次，ECL化学发光法检测：取ECL发光液A和B等量混匀，加在膜的正面，暗室避光5min，倒掉显色液，用纸吸取显色液，在上面盖上一层平整的透明纸，将其放入成像系统中进行扫描。

1.7 实时荧光定量PCR法检测胃及下丘脑内ghrelin通路相关mRNA表达

按照RNA试剂盒说明，从胃及下丘脑组织中提取总RNA。然后按照反转录试剂盒说明配制反转录反应体系，总体积为25 µL，其中含RNAPrimer Mix 12 µL、5×RT Reaction Buffer 5 µL、25 mmol/L dNTPs 1 µL、25 U/µL RNase Inhibitor 1 µL、200 U/µL M-MLV RTase 1 µL、Oligo（dT）18 Primer 1 µL、ddH2O（DNase-free）4 µL。反转录反应条件为：37℃ 60 min，85 ℃5 min，4 ℃ 5 min。RNA反转录成cDNA后，取2 µL cDNA模板，使用SYBR Green PCR试剂盒进行目的基因的PCR扩增。PCR体系总体积为25 µL，其中含SYBR Green Mix 12.5 µL、上下游引物各0.5 µL、ddH2O 9.5 µL和cDNA模板2 µL。PCR反应条件：95 ℃初始化10 min；然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，连续40个循环；最后60 ℃退火15 s。PCR所用引物的序列见表1。以GAPDH作为内参基因，测得循环阈值（cycle threshold，Ct），用2-ΔΔCt法[9]计算ghrelin、GHSR、leptin、AMPKα2、NPY和AgRP mRNA的相对表达量。

1.8 统计分析

采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析。计量资料数据以±s表示。组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 应激对大鼠拒俘反应的影响

在实验过程中，观察到夹尾刺激会导致大鼠易于被激怒，出现互相打斗的现象。在造模第1、7、21天，每组随机选取8只大鼠观察其拒俘反应。结果显示：应激组大鼠在第1、7、21天拒俘反应记分明显高于对照组（P＜0.01，图1A），表现为尖叫、回避、挣脱，甚至有攻击和撕咬行为，提示应激大鼠表现出明显的抵抗性。

表 1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

2.2 应激对大鼠体质量与摄食的影响

在应激7 d后，应激组每笼大鼠的总摄食量为（308.90±14.34）g，较对照组的（296.55±7.54）g明显增加，两组之间差异有统计学意义（P＜0.05，图1B）；而在应激14 d及21d时两组大鼠的每笼总摄食量差异无统计学意义（P＞0.05，图1B）。每周对两组大鼠体质量进行监测，结果显示应激7、14、21 d时的大鼠体质量与对照组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05，图1C）。

图 1 各组大鼠拒俘反应（A）、摄食量（B）和体质量（C）比较Figure 1 Capture-resistance (A), food intake (B) and body weight (C) of rats in two groups

2.3 应激对大鼠血清酰基化ghrelin水平的影响

用ELISA法测定两组大鼠第7及第21天时血清中酰基化ghrelin水平，结果如图2所示。应激7 d及21 d时大鼠血清酰基化ghrelin水平均较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 应激对大鼠胃内ghrelin蛋白表达及下丘脑内ghrelin、AMPKα2蛋白表达的影响

用蛋白质印迹法测定两组大鼠胃内及下丘脑内ghrelin蛋白表达水平，结果如图3所示。应激7 d和21 d时大鼠胃及下丘脑内总ghrelin蛋白表达水平明显高于对照组（P＜0.05），而且下丘脑内AMPKα2蛋白表达水平也明显高于对照组（P＜0.01）。

图 2 ELISA法检测各组大鼠血清酰基化ghrelin水平Figure 2 Serum levels of acylated ghrelin in two groups of rats detected by ELISA

图 3 蛋白质印迹法检测两组大鼠胃及下丘脑内ghrelin、AMPKα2蛋白表达Figure 3 Expressions of ghrelin and AMPKa2 proteins in stomach and hypothalamus in two groups of rats detected by Western blotting

2.5 应激对大鼠胃内及下丘脑内食欲相关基因表达的影响

实时荧光定量PCR法检测两组大鼠食欲相关基因的表达水平，包括胃内ghrelin、GHSR、leptin以及下丘脑内ghrelin、AgRP、NPY、AMPKα2。结果如图4所示，应激7 d和21 d后大鼠胃内ghrelin及GHSR的mRNA水平明显高于对照组（P＜0.01），而应激组胃内leptin的mRNA水平明显低于对照组（P＜0.01）；另外，应激组大鼠下丘脑中ghrelin、AgRP、NPY、AMPKα2的mRNA水平均明显高于对照组（P＜0.01）。

图 4 实时荧光定量PCR法测定两组大鼠食欲相关基因mRNA表达水平Figure 4 mRNA expressions of appetite-related genes in two groups of rats measured by real-time fluorescent quantitative PCR

3 讨论

Ghrelin与食欲的调节相关。本研究中检测了大鼠血清酰基化ghrelin水平，以及胃和下丘脑组织中ghrelin蛋白表达水平，同时测定了食欲反馈通路上一些相关基因的表达，如胃内GHSR、leptin，以及下丘脑内AMPKα2、NPY、AgRP mRNA水平。研究结果表明，应激能上调大鼠血清酰基化ghrelin水平，上调大鼠胃及下丘脑中ghrelin蛋白表达；也能导致与食欲促进相关的胃内ghrelin、GHSR mRNA水平以及下丘脑内ghrelin、AgRP、NPY、AMPKα2 mRNA的水平明显升高，下调与食欲抑制相关的胃内leptin水平。本研究也监测了大鼠摄食量及每周的体质量。在21 d的实验过程中发现，第7天应激组每笼大鼠总摄食量增加，提示7 d应激状态下大鼠食物摄入量的增加可能与其血清酰基化ghrelin、胃及下丘脑内ghrelin表达水平的升高相关。本研究结果提示，ghrelin参与了应激大鼠食欲反馈通路的调节，应激能上调大鼠体内ghrelin水平，进而导致摄食量的增加。

既往研究已经证明，ghrelin是一种参与食欲调节的因子，能增加实验动物对食物摄入的渴望[10-11]。位于下丘脑的ghrelin神经元能通过激活下丘脑NPY/AgRP信号、阿片促黑素皮质激素原（proopiomelanocortin，POMC）和促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）神经元，向大脑传递饥饿信号，从而增强食欲，进而调节机体能量自稳态[12]。而在食欲调节反馈通路上，NPY/AgRP信号、AMPK也是喂养-能量稳态控制系统的关键因素[13-15]。Ghrelin具有促进胃酸分泌、调节胃肠运动、增进食欲等重要生理功能[16]，在GHSR基因敲除小鼠中发现其胃排空时间延迟[17]，提示ghrelin是一种内源性的食物摄入调节因子。在对人群纵向随访中也发现，高水平的ghrelin与高度的食物渴望相关[18-19]。

本研究还检测了对食欲有抑制作用的胃内leptin mRNA水平。Leptin是一种脂肪细胞来源的激素，参与调节食物摄入与能量代谢，具有抑制食欲、减少摄食的作用[20]。7 d应激虽然会增加大鼠总食物摄入量，但对其体质量没有明显影响。本研究还发现大鼠AMPK水平上调。研究显示，激活的AMPK通过对脂肪、蛋白质和糖类代谢的调控，维持体内能量平衡[21]。笔者推测，摄食增加，而体质量未增加，可能与压力激活交感神经系统导致的代谢增加有关；应激状态下，交感神经系统的激活会增加呼吸频率、血压和心率，并激活分解代谢通路，这时糖原被水解，葡萄糖异生作用被刺激，为需要大量能量的组织（主要是大脑、骨骼和心肌）提供葡萄糖；AMPK也对脂肪、糖类代谢进行调控，以应对体内平衡的威胁[22]。

除了促进食欲以外，ghrelin具有减少胰岛素分泌、调节葡萄糖稳态[23]、抗肌肉萎缩[24]等作用。另外，ghrelin与抑郁的相关性也是目前的研究热点之一。多项研究发现，抑郁症患者的血清ghrelin水平较健康人升高，在抗抑郁治疗后血清ghrelin水平下降[25-27]；在抗抑郁药耐药患者中，血清ghrelin水平也维持稳定[28]。编码ghrelin的核苷酸多态性已被证实与人类抑郁症发生风险有关[29]。在一些动物实验中发现，食物剥夺、足部电击、社交失败、强迫制动或慢性不可预测温和应激等生理或心理应激源均能刺激啮齿类动物的ghrelin释放[30]；这与本实验结果相吻合。因此，笔者推测暴露于应激源下，大鼠外周及中枢ghrelin的水平升高可能是为了应对压力的一种稳态适应，与其负性情绪相关。

另一方面，本研究还发现，应激组大鼠虽然血清、脑、胃ghrlein水平持续高于对照组，但至第14、21天统计两组大鼠的总摄食量无明显差异，两组大鼠的体质量也无明显差异。已知啮齿类动物暴露于急性和慢性应激源对食物摄取量和体质量有影响，而且胃ghrelin系统在应激相关的进食行为中发挥作用，但这一机制尚未完全探明。在亚慢性和慢性束缚应激模型中，食物摄入通常会受到负面影响，同时伴随体质量下降或对体质量无影响[31-33]。已有研究证实，慢性压力是人类抑郁形成的主要因素。对动物的慢性应激能够引起类似临床症状的行为变化，如快感缺乏、体质量减轻和运动/活动不足。在21 d应激状态下，ghrelin水平升高但摄食量并未增加，推测可能与大鼠负性情绪相关。研究表明，2周慢性应激足以诱发类似抑郁的行为[34]。在持续性应激状态下，大鼠摄食从以增加食物为代价来缓解类似焦虑和抑郁症状，转变为逐渐摄食减少，这可能与其抑郁状态下行为绝望有关。

本研究尚存在一定的局限性，如本次研究未观察大鼠行为学与应激及摄食的相关性。下一步研究拟结合动物行为学持续动态观察应激对大鼠脑胃ghrelin通路的影响，进一步研究ghrelin异常与应激导致的负性情绪及摄食行为的相关性。

综上所述，应激会导致大鼠外周及中枢ghrelin水平的升高，以及ghrelin通路中食欲相关因子的异常表达，但ghrelin系统在应激相关的进食行为中的作用及其机制尚待进一步研究。