黔产八角莲超声提取工艺的优化*
2021-07-02孙晓惠陆锦锐胡志平陆廷祥杨政菊
孙晓惠，陆锦锐，胡志平，陆廷祥，杨政菊
(黔南民族医学高等专科学校，贵州 黔南 558000)
黔产八角莲属药材主要为八角莲[Dysosma versipellis(Hance)M.ChengexYing]、贵州八角莲[D. majorensis (Gagnep.)Ying]、川八角莲[D. veitchii (Hemsl. et Wils.)FuexYing]和小八角莲[D. difformis (Hemsl.et.Wils.)T.H.WangexYing][1]。具有化痰散结、祛瘀止痛、清热解毒的功效，临床用于治疗多种癌症以及咳嗽、咽喉肿痛、瘰疬、瘿瘤、跌打损伤、风湿痹痛、疮疡肿毒、蛇虫咬伤等证[2]。化学成分研究发现本品根及根茎含有抗癌成分鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚等[3]，具有广阔的开发前景。目前有关八角莲中鬼臼毒素等成分提取工艺的研究仅见其回流提取[4-5]，故本实验对其超声提取工艺进行优化，为工业生产提供基础。
1 仪器和试剂
1.1 仪 器
Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；KQ3200超声波清洗器，昆山美美超声仪器有限公司；JA2003N电子天平，上海菁海仪器有限公司；2500C多功能粉碎机，永康市艾泽拉电器有限公司。
1.2 试 剂
鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚标准品，均购自北京百灵威科技有限公司，编号分别为131142、203057、268623、258643；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司。
1.3 药 材
主要对贵州都匀、荔波、福泉、赫章等县市的八角莲属药材资源进行了野外考察和样品收集，收集的八角莲属药材样品由黔南民族医学高等专科学校生药教研室王传明副教授鉴定，分别为八角莲Dysosma versipellis(Hance)M.ChengexYing、贵州八角莲D. majorensis (Gagnep.)Ying、川八角莲D.veitchii (Hemsl.et Wils.)FuexYing和小八角莲D.difformis (Hemsl.et.Wils.)T.H.WangexYing。
2 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液
精密称取鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚标准品适量，加甲醇分别制成浓度为1.530、0.0212、0.1490、0.2040 mg/mL的溶液。
2.1.2 供试品溶液
精密称取过三号筛的药材粉末1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加50 mL甲醇称定质量，超声30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2.2 HPLC测定鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚含量
2.2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250 mm,5 μm)；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：290 nm。流动相为A乙腈，B 0.1%磷酸溶液。梯度洗脱条件：0～15 min B 75%～70%;15～25 min B 70%-50%。色谱图见图1。
图1 HPLC图
2.2.2 线性关系考察
精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液适量，加甲醇逐级稀释成相应质量浓度，在“2.2.1”项色谱条件下进样20 μL测定。以溶液质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程分别为
鬼臼毒素：Y=11508X+150.99，R=0.9999
4′-去甲基鬼臼毒素：Y=12566X+1.2391，R=0.9999
槲皮素：Y=25239X-8.3921，R=0.9999
山奈酚：Y=31778X-16.622，R=1.0000
分别在65.68×10-3～3.049 mg/mL、0.9359×10-3～0.04233 mg/mL、7.460×10-3～0.2990 mg/mL、10.27×10-3～0.4084 mg/mL范围内线性关系良好。
2.2.3 精密度试验
取鬼臼毒素标准品20 μL自动进样，重复6次，测定峰面积，结果鬼臼毒素的RSD为0.72%，表明仪器精密度良好。
2.2.4 重复性试验
精密称取同一药材粉末6份，按“2.1.2”项下制备供试品溶液，按“2.2.1”项下进样测定。测得各成分含量RSD分别为1.06%(鬼臼毒素)、0.89%(4′-去甲基鬼臼毒素)、1.12%(槲皮素)、0.93%(山奈酚)(n=6)，表明本方法重复性良好。
2.2.5 稳定性试验
取同一供试品溶液分别在0，2，4，8，12，16，24 h进样20 μL，依法测定峰面积，结果RSD分别为0.39%、1.79%、1.38%、0.60%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定。
2.2.6 加样回收率试验
精密称取12份已知含量的药材粉末(每份0.5 g)，3份作为对照，另外9份分成低、中、高3组(n=3)，分别加入低、中、高3个不同浓度的混合对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下，进样20 μL，测定4个成分的峰面积，计算回收率，结果各成分的平均加样回收率分别为102.7%(鬼臼毒素)、99.2%(4′-去甲基鬼臼毒素)、101.5%(槲皮素)、98.9%(山奈酚)，RSD分别为1.5%、2.1%、2.5%、2.3%。
2.3 正交试验
2.3.1 正交试验结果
根据预实验及相关文献，确定料液比A、甲醇体积分数B、提取时间C作为影响因素，各因素取3水平，设计L9(34)正交试验。因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表3。
表1 因素水平
表2 试验设计及结果
表3 方差分析
由表2可知，各因素对提取效果的影响程度依次为B>A>C，即甲醇体积分数>料液比>提取时间；由表3可知，因素B有显著性影响(P<0.05)，而因素A、C无显著性影响；最优工艺为B2A1C3，即甲醇体积分数80%，料液比1:10，提取时间40 min。
2.3.2 验证试验
精密称取6份药材粉末，按“2.3.1”项下最优提取条件制备供试品溶液，测得4种成分总含量平均为13.15 mg/g，高于表2最高值12.81 mg/g，表明工艺稳定可行。
3 结 论
实验首次对黔产八角莲根茎中鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚4种成分进行了超声提取工艺研究，最优的提取工艺是用80%甲醇，料液比1:10，超声提取时间为40 min。超声提取八角莲方法工艺简单、方便、稳定、可行，可用于八角莲中化学成分的提取。
