日粮纤维对竹鼠生长及肠道菌群组成的影响

2021-07-02周可心吴允正戴益民董思琦胡永强张文韬张锦华

现代畜牧兽医 2021年6期

周可心，吴允正，戴益民，董思琦，杨磊，胡永强，张文韬，张锦华

（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045）

竹鼠（Rhizomyidae）在动物分类学上属于脊椎动物亚门、哺乳纲、啮齿目、竹鼠科、竹鼠属。竹鼠没有饮水的习惯，主要从食物中摄取水分来满足机体对水分的需求。竹鼠是以植食性为主的动物，其日粮以竹根、竹茎、芒草根及农作物秸秆为主，再辅以大米、米糠、玉米等精料。竹子的化学成分主要为纤维素、半纤维素、木质素等不易消化的纤维，竹材含水量在45.18%左右[1-2]。因此，竹鼠养殖主要以江西、广西等丰富的竹资源储量的区域为主，其他地区则受到一定限制。在竹鼠养殖业中，胃肠道疾病是造成竹鼠死亡的主要病因，因此需要重视竹鼠的肠道环境的健康。肠道菌群能影响宿主肠道的生长、发育、营养物质吸收能力及免疫力，对肠道和宿主健康至关重要[3]。肠道菌群会因生存环境、年龄、饮食等因素而发生改变[4-6]。其中，饮食起决定性作用[7]。竹鼠作为植食性动物，有较长的消化道和发达的大肠、盲肠。其肠道内有大量的微生物，能充分发挥发酵作用来消化吸收竹子等难消化的食物[8]。竹鼠日粮的竹茎成分含量发生变化时，其肠道菌群也会发生相应改变，进而导致机体机能发生改变。

本试验旨在研究日粮中纤维成分对竹鼠的生长及其肠道菌群的影响，进而研究竹鼠肠道优势菌群的组成，为筛选产纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶的菌株来源提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物为日龄相近、健康状态良好、体重（约1 kg）接近的6只中华竹鼠（公、母各半），由宜丰县一竹鼠养殖示范基地提供。

1.2 试验设计及饲养管理

采取单因素随机试验设计，将6只竹鼠随机分为2组。试验组添加含0%竹茎，对照组投喂40%竹茎，试验日粮组成及营养水平见表1。

表1 试验日粮组成及营养水平（风干基础）Tab.1 Test diet composition and nutritional level(air-dry basis)

试验组竹鼠和对照组竹鼠分别放于两个竹鼠池中喂养。每天饲喂2次（8：00和17：00）。每只成年竹鼠饲料饲喂总量为90 g 左右。试验于江西农业大学动科院传染病兴趣小组动物房进行，为期45 d。试验期间，观察并记录对照组和试验组竹鼠的健康状况、牙齿长度等。

1.3 样品采集及检测

在试验中，试验组竹鼠分别于第23、37、45 d死亡。将病死竹鼠解剖，截取肠段，取肠道内容物于Ep 管中，放于-20 ℃保存，并进行编号为cg、cm、ch。同时，分别取对照组竹鼠新鲜粪便放于Ep管中，并编号为fg、fm、fh。将样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行细菌16S rDNA的V3~V4区高通量测序。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用软件SPSS 17.0进行统计分析。菌群分析采用t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。将所有样本序列按照序列间的距离进行聚类，然后根据序列之间的相似性将序列分成不同的操作分类单元（OTU）。基于运算分类单元在97%相似水平下进行样品的生物信息统计分析。利用香农（Shannon）指数、辛普森（Simpson）指数公式计算细菌多样性，Chao 指数公式计算细菌丰富度，并在各个水平上对每组样品进行物种组成和差异性比较分析。

2 结果与分析

2.1 日粮纤维对竹鼠生长性能的影响

试验组竹鼠日粮成分缺乏竹茎时，相继发生精神沉郁、四肢无力、进食减少、消瘦、粪便偏小偏干等情况，最后死亡。肉眼观察试验组和对照组竹鼠，除上述症状之外，试验组竹鼠牙齿平均长度在2.2 cm左右，对照组竹鼠牙齿平均长度1.5 cm左右。解剖病死竹鼠，未见实质器官有明显病变。

2.2 日粮纤维对竹鼠肠道菌群多样性的影响（见表2、图1、图2）

表2 各组微生物菌群和多样性指数Tab.2 Microbial flora and diversity index in each group

由表2、图1 可知，香农指数稀释曲线接近平缓，覆盖率在99.86%~99.92%，说明对竹鼠肠道菌群的检测比率接近饱和状况，能覆盖样品绝大部分的菌群，数据合理。分别在试验第27、37和45 d对试验组采样，且每个时间点采样的数量为1，因此组内差异小，并符合统计学分析。试验组、对照组分别为224 和335 个运算分类单元。各样品通过样品测序序列计算得到的多样性指数中，试验组的香农指数更大，辛普森指数更小，试验组与对照组的香农指数和辛普森指数差异不显著（P>0.05），多样性相似；各样品通过测序序列计算算得的丰富度指数中，对照组的菌群丰富度大、物种丰富度更高，试验组与对照组的chao和ace指数差异及显著（P<0.01），丰富度有明显变化。为了进一步从属水平上分析试验组和对照组样品的菌群多样性的关系，因此构建维恩图（Venn）。由图2可知，两组共有109个运算分类单元，分别占两组样品全部属的73.65%、65.27%；试验组特有39 个运算分类单元，较对照组58 个运算分类单元略低。

图1 基于运算分类单元水平的肠道菌群稀释曲线Fig.1 Rarefaction curve of intestinal microbial flora at OTU level

图2 基于运算分类单元水平的肠道菌群韦恩图Fig.2 Venn diagram of intestinal microbial flora at OTU level

2.3 日粮纤维对竹鼠肠道菌群组成的影响（见图3~图6）

由图3、图4可知，试验组和对照组竹鼠的6个肠道中样品微生物菌落主要由16个门组成，在合并小于百分之一的区域内。试验组中常见的3个门为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria），分别占样品包含的物种总数目的55.67%、23.32%、8.19%，对照组中常见的3个门为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门，分别占样品包含的物种总数目的40.80%、33.17%、20.18%。对两组样品物种差异分析表明，当竹鼠饮食结构发生改变时，其肠道微生物组成会发生改变。其中，试验组互养菌门（Synergistetes）丰度极显著高于对照组（P<0.01），试验组厚壁菌门丰度极显著高于对照组（P<0.01），试验组蓝藻菌门（Cyanobacteria）丰度极显著低于对照组（P<0.01），试验组变形菌门丰度显著低于对照组（P<0.05）。当竹鼠饮食结构缺少竹茎成分时，原本优势的变形菌门、蓝藻菌门丰度降低，而厚壁菌门丰度增加，变为此时的优势菌，其中互养菌门细菌数量丰度上升趋势最为明显。

图3 肠道微生物在门水平上的相对丰度Fig.3 Relative abundance of gut microbiota at phylum level

图4 肠道微生物门水平上差异检验Fig.4 Differences in gut microbiota at phylum level

由图5、图6可知，在属水平上对试验组和对照组的样品菌群结构进行统计分析，在合并小于百分之一的区域内。试验组中占优势的菌属分别为拟杆菌属（Bacteroides）、断链真杆菌属（[Eubacterium]_fissicatena_group）、Hungatella，分别占样品包含的物种总数量的15.69%、11.20%、9.70%；而对照组占优势的菌属分别为大肠杆菌志贺菌属（Escherichia-Shigella）、norank_f_Muribaculaceae、Ralstonia，分别占样品包含的物种总数量的28.39%、27.69%、8.81%。当竹鼠饮食发生改变时，肠道的优势菌属由变形菌门的大肠杆菌志贺菌属和Ralstonia变为厚壁菌门的断链真杆菌属、Hungatell；同时，试验组肠道菌群特有Cloacibacillus、Lachnoclostridium、梭杆菌属（Fusobacterium）等多种菌属。用student's T检验对两组间差异显著性分析，由图6c 可知，试验组norank_f_Muribaculaceae丰度极显著低于对照组（P<0.01），试验组Cloacibacillus丰度极显著高于对照组（P<0.01），试验组变形菌门的脱硫弧菌属（Desulfovibrio）丰度极显著高于对照组（P<0.01），试验组Ralstonia丰度极显著低于对照组（P<0.01），试验组厚壁菌门的八叠球菌属（Sarcina）丰度显著低于对照组（P<0.05），试验组厚壁菌门的考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）丰度显著高于对照组（P<0.05），试验组变形菌门的大肠杆菌志贺氏菌属丰度显著低于对照组（P<0.05）。

图5 肠道微生物在属水平上的相对丰度Fig.5 Relative abundance of gut microbiota at genus level

图6 肠道微生物在属水平上的差异分析Fig.6 The difference analysis of intestinal microbes at the genus level

3 讨论

3.1 日粮纤维对竹鼠生长性能的影响

本试验中，观察到日粮中缺乏竹茎会导致竹鼠牙齿变长。竹鼠的门牙在啃食竹茎这种韧性强的食物过程中需不断摩擦，使得门牙釉质能够发育成正常的微观结构，以保持良好的机械性能，正常的生长速率和强度[9]。而当失去这种韧性强的食物组成时，竹鼠牙齿的机械性能下降，门牙生长速度远大于磨损速度，使得门牙过长；且水分摄取减少会影响养料的吸收，均会导致竹鼠无法摄入足够的营养物质影响竹鼠的生长。竹鼠这种嗜纤维的食性使其肠道菌群的组成较为特殊，肠道菌群通过参与宿主体内糖、蛋白质和脂肪等营养大分子物质的代谢，进而影响营养物质的消化、吸收和代谢[10]。当日粮缺乏竹茎时会造成肠道内优势菌群发生改变。这种通过肠道菌群变化导致营养物质消化吸收差异也会影响竹鼠的生长。

3.2 日粮纤维对竹鼠肠道菌群的影响

动物肠道菌群的平衡极易受饲养环境、饮食、自身免疫力等因素的影响，这种平衡一旦被打破，则会增加肠道疾病发生的概率[11]。本试验从肠道菌群的角度分析，试验组竹鼠因日粮纤维组成改变导致的生长受到影响到死亡的原因。从门水平可知，试验组竹鼠厚壁菌门和互养菌门丰度显著增加。李彦红[12]报道，在厌氧消化产甲烷阶段，厚壁菌门和拟杆菌门为产甲烷过程的优势群落，螺旋菌门、互养菌门和绿弯菌门是产甲烷阶段的新增菌群。肠道内环境中产甲烷菌与乙酸生成菌是重要的氢利用菌，两者同时存在相互竞争[13]，肠道内产甲烷菌数量显著增加可能对乙酸生成菌造成影响，乙酸是一种短链挥发性脂肪酸，乙酸进入细胞会解离出氢离子，乙酸生成量减少，可能会导致肠道pH值上升，利于条件致病的生长。

从属水平上，试验组竹鼠肠道内变形菌门的脱硫弧菌属数量呈上升趋势。丁俊荣等[14]报道，肠道中脱硫弧菌属的数量增加，会使硫化氢的数量增加。内源性的硫化氢会对肠道上皮细胞产生毒害作用，阻碍结肠细胞对丁酸盐氧化途径，引发细胞凋亡和慢性炎症。与对照组竹鼠相比，试验组竹鼠肠道内新增梭杆菌属等多种菌属；极少出现在人肠道菌群中的梭杆菌在肠癌患者肠道中活跃[15]。李菁等[16]研究发现，具核梭杆菌在小鼠肠道内定植会使肠道菌群失衡和调控肠黏膜肿瘤相关免疫因子表达等方面促进小鼠结肠肿瘤发生。从肠道菌群生态系统的稳定性来看，物种之间的相关性越紧密越复杂，菌群结构越稳定，其功能也越健全，日粮组成结构的改变导致竹鼠肠道微生物组成发生变化，从而影响竹鼠肠道对营养物质的消化与吸收，可能是诱导竹鼠肠道产生慢性炎症甚至死亡的主要因素之一。

3.3 竹鼠肠道菌群分析对畜牧业的实践意义

竹鼠是一种以竹子、芒草、植物茎秆等为食的植食性动物，与大熊猫食性相似，竹鼠每日也必须进食富含纤维素、半纤维素和木质素等的食物来维持营养需要。而动物的日粮组成会对动物肠道菌群起决定性作用。赵梦迪等[17]研究发现，湖羊瘤胃内优势菌群均为拟杆菌门和厚壁菌门。罗亚等[18]研究表明，大熊猫以高纤维的竹子为主食，其肠道中也检测到大量厚壁菌门，且厚壁菌门占大熊猫肠道细菌总量的78%以上。厚壁菌门是动物肠道中主要的纤维素分解菌，能够降解纤维转化为挥发性脂肪酸供宿主使用[19]。目前，已从大熊猫肠道内分离鉴定到多株纤维素降解菌，并有作为益生菌的潜能[20-24]。纤维素降解菌产生的纤维素酶可将纤维素降解成还原糖，还原糖可作为生成乙醇、丙酮的原料。利用这一原理，可将纤维素降解菌应用到饲料工业中，促进动物对纤维素的消化和吸收，同时增加体内纤维素酶的含量。宁俊平[25]、曹晓燕等[26]均从竹鼠肠道中分离到纤维素降解菌，且都有良好的降解纤维素的能力。Wongwilaiwalin 等[27]报道，降解木质纤维素的微生物主要由拟杆菌门和厚壁菌门下的菌属组成；试验组厚壁菌门的八叠球菌相对丰度显著低于对照组。

Ranganathan等[28]在小鼠的临床试验中发现，每天服用八叠球菌的患病小鼠，其血液中的尿素氮水平会显著下降，患病小鼠的生存时间也会显著延长，可见八叠球菌对竹鼠肠道健康有一定的益生作用。Lagkouvardos等[29]研究发现，在小鼠肠道微生物群中，拟杆菌门的Muribaculaceae占主导地位，但由于它们直到最近才被培养出来，其与宿主之间的相互作用还尚未明确，有待试验的进一步研究。本试验通过16S rDNA高通量测序对竹鼠肠道菌群分析发现，正常竹鼠拟杆菌门下的norank_f_Muribaculaceae丰度极显著高于试验组，从而推测norank_f_Muribaculaceae可能对竹鼠肠道降解木质纤维素、对纤维素的消化和吸收起重要作用。