1 例利用瘘管进行牛活体取卵的研究

黄承俊，张文军，王 格，李 宁

（辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳110032）

活体卵母细胞是进行试验研究、保种育种、动物繁殖等的材料[1-2]。目前，B 超法活体采卵是较为理想的方式，但需要B 超仪与经验丰富的工作人员相配合[3-5]。因此，方便可持续性获取活体卵母细胞的方法仍在探索中。

在解剖生理上，空怀牛的卵巢多位于骨盆腔内，经产及妊娠牛的卵巢往往吊在腹腔靠近体壁处，并由系膜悬挂，具有一定的可延伸性。右侧髋关节前水平线稍下的腹壁处是离卵巢最近，且可安装瘘管的位置[6]。如果卵巢位于腹腔内，加上卵巢系膜的延展性，通过此处安装瘘管，将体内卵巢取出具有一定的可行性。如果卵巢位于骨盆腔内，将其系膜和韧带部分割断，仍具有取出的可能性。本试验通过瘘管，结合超数排卵技术[7]，进行可持续性的获得活体卵母细胞，为卵母细胞的获取方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

沿江初产母牛1头，3周岁。两侧卵巢完整，均位于骨盆腔内。

1.2 仪器与试剂

SZM7045B1 体视显微镜（深圳市泰宇星光电仪器有限公司）、直径10 cm 瘘管（武汉科立搏牧业科技有限公司）。

LA1812 PBS磷酸盐缓冲液（Labcoms）。

1.3 瘘管安装

1.3.1 术前准备

试验牛禁食24 h，禁水12 h。准备好相关手术器械和药品。瘘管用开水烫至软化。

1.3.2 保定与麻醉

将牛保定在单排结实的铁栅栏一侧。术部去毛和消毒，利用硬膜外腔麻醉法进行麻醉[8]。

1.3.3 安装瘘管

术部位于髋关节与最后肋骨间靠近髋关节一侧。开口上缘在髋关节与最后肋骨水平连线下8 cm。用针头以瘘管塞为中心，上下左右扎4个点位确定位置，并渐退式注入麻药。沿确定好的范围剪除皮肤、肌肉和脂肪，并将切口处的表皮与肌肉连在一起进行结节缝合。最后装上瘘管[9]，涂抹上红霉素软膏。

1.4 瘘管牛的管理

术后用多层纱布包裹住瘘管部，并按常规手术进行消炎治疗，连续7 d[10]。治疗结束后，牛的精神状态恢复正常，即开始采卵试验。

1.5 系膜的割断

试验牛硬膜外腔麻醉后，通过直肠将腹膜贴于瘘管口，用手术刀将腹膜切开一条能伸进手的裂缝。通过直肠将卵巢固定，将夹有手术刀片的手通过裂缝伸到卵巢的位置，通过手指把握卵巢的方式，将悬挂卵巢、子宫角的系膜与韧带部分割断，同时向瘘管口拉扯，直到卵巢可以取卵为止。连接卵巢、输卵管的韧带中有血管，切割点以子宫角处为主。

1.6 卵母细胞的获取

使用含2 mL PBS液的10 mL注射器，从侧面吸取卵巢表面上2~8 mm 卵泡的卵泡液，将吸取的液体倒入直径120 mm的细菌培养皿中，并于显微镜下观察统计。

2 结果与分析

2.1 瘘管的安装（见图1）

图1 瘘管的安装Fig.1 The fistula installed

由图1 可知，瘘管安装于牛右侧髋关节前水平线稍下的腹壁处，也是离卵巢最近且可安装瘘管的地方。试验中未将腹膜打开，瘘管仅安装在肌肉层。

2.2 卵巢的拉出（见图2）

试验牛两侧卵巢均位于骨盆腔内，离瘘管口较远，需进行系膜割断手术。

由图2可知，两侧卵巢均有不同程度的囊肿，右侧较为严重，直肠把握时可感觉有硬块存在。囊肿都发生在卵巢的顶部，在拉出时表现为靠外。

2.3 活体采卵（见图3）

图2 卵巢的形态Fig.2 The feature of ovary

图3 卵丘-卵母细胞复合体Fig.3 The cumulus-oocyte comples

由图3 可知，两侧卵巢表面均无突出的大卵泡。右侧卵巢共吸取3 针，捡卵1 枚。左侧卵巢共吸取6 针，捡卵2枚。活体卵均为卵丘-卵母细胞复合体（COC）形态。

3 讨论

本试验探索1种利用瘘管进行牛活体采卵的方法。共取得卵丘-卵母细胞复合体3 枚，说明该方法能够实现活体采卵的目的。

本试验中，瘘管安装于牛右侧髋关节前水平线稍下的位置。该位置位于腹部外侧，也是离卵巢最近且可安装瘘管的地方。理论上，如果卵巢位于腹腔内，右侧卵巢便位于瘘管口靠后一点的位置。此外，牛子宫呈羊角状，卵巢、输卵管和子宫角有系膜和韧带固定。如果将其展开，整个子宫加输卵管有50 cm 左右的长度[11-12]，足够将卵巢拉出体外。试验中未将腹膜打开，瘘管仅安装在肌肉层，可以降低安装瘘管的难度，减少试验牛内脏被感染的风险，有利于保护卵巢。本试验方法在采卵时打开1个裂缝，采卵后裂缝自动愈合，形成封闭的环境。

试验牛为初产牛，卵巢位于骨盆腔内，不能直接拉出瘘管口，需将子宫角、卵巢的系膜和韧带进行部分割开。试验中需两人配合操作。一人通过直肠固定好卵巢，另一人通过瘘管口将系膜韧带割断并拉出卵巢。这种手术有一定的风险，容易对卵巢、输卵管供血系统造成损伤或引起子宫脱。因此，试验中需反复确认手术的位置。相对初产母牛，经产牛和老龄化牛的卵巢则位于腹腔内，更接近手术部位[6]。用淘汰高产母牛做试验，或许难度较低，价值更大[13]。

试验共取得3 枚卵子，均为卵丘-卵母细胞复合体形态。就采卵数而言，与未实施超排技术的B超法活体采卵相比差别不大[14-15]。但该方法卵巢囊肿较为严重，可能与药物的使用和手术应激有关[16]。解决囊肿问题是提高采卵数、开展可持续采卵的关键。

4 结论

利用瘘管能够获得牛的活体卵，但易引起卵巢囊肿。