肾阳虚证动物模型造模方法及模型评价＊

2021-07-02唐维我张会永杨关林

世界科学技术-中医药现代化 2021年4期

唐维我，张会永，李芹，李佳，杨关林

(1.辽宁中医药大学研究生院沈阳 110032；2.辽宁中医药大学附属医院沈阳 110032)

肾阳虚证是中医常见证候之一，又称作元阳亏虚证、命门火衰证，是由于肾阳亏虚、机体失于温煦所致，临床以畏寒肢冷，腰膝以下尤甚，面色晄白或黧黑，小便清长，夜尿多，舌淡苔白，脉弱等为主要表现[1]。目前的动物实验中对比《中医虚证辨证参考标准》中的临床肾阳虚症状作为造模成功与否的标志[2]。肾阳虚证临床表现中的畏寒、小便清长、夜尿多，在动物行为中表现为蜷缩喜堆，小便清长、量多；肢冷可通过测量体表温度得知；喜温、倦怠可通过观察动物的行为学表现获得，表现为蜷缩聚堆、精神不振、反应迟钝、活动减少、肢体力量下降等；舌脉可在动物体直接观察。肾阳虚证在呼吸、循环、内分泌、消化等系统的疾病中均有表现，为了更好的治疗肾阳虚所引起的疾病，学术界一直致力于肾阳虚证本质的研究，并探索出多种复制肾阳虚动物模型的方法。但由于动物种类、造模方法繁多，用药种类、给药方式均不相同，造模时间也长短不一，且造模后动物出现的宏观表征各不相同，并且评价模型所用的微观指标也各有差异，暂无模型成功的系统评判标准，因此如何选取适合的动物模型以及造模方式为临床治疗此类病症具有重大意义。本文于CNKI、维普、万方数据库中，以“肾阳虚证”“肾阳虚模型”“温肾助阳”等为检索词，查阅自1959年至2020年4月有关肾阳虚及肾阳虚相关疾病动物实验的文献共567篇，总结其造模方法及评价标准，并对其进行分析与探讨。

1 模型动物

在肾阳虚动物模型的选取中以大鼠小鼠为主，也有少部分实验应用了家兔[3]、豚鼠[4]与小型猪[5]，但大型的哺乳动物，例如猴、狗等应用较少。虽然小型哺乳动物有易操作、成本低的优点，但大型哺乳动物的生理生化指标与人类更加接近[6]，因此现在的造模方式依然存在着一些局限。

2 造模方法

2.1 现代医学病理造模

2.1.1 药物造模

应用药物造模的方法中多使用糖皮质激素、抗甲状腺药、性激素、羟基脲、腺嘌呤。1963年邝安堃等[7]首次通过氢化可的松肌注的方法，使小鼠出现体质量降低、尿量增加、蜷缩萎顿、毛发萎黄无光泽等类似肾阳虚的症状；1984年，夏宗勤等[15]首次使用他巴唑在小鼠上建立了肾阳虚模型，发现小鼠的cAMP/cGMP比值下降，耗氧率明显降低，但未对小鼠的行为学进行评价；随后还有学者利用雌二醇或睾酮在动物体复制肾阳虚模型[16]，出现了皮毛无光泽、竖毛，背腹部潮湿出汗，蜷缩，精神萎靡，反应迟钝，体重降低等表现。此3种方法都是通过模拟下丘脑-垂体-靶腺轴受抑制的病理状态，使动物表现出“肾阳虚”的表现。

此外，常用的方法还有羟基脲灌胃[17]，这是因为羟基脲可抑制核苷酸的代谢与DNA的合成，使蛋白质代谢发生相应的改变，导致动物出现毛发枯槁疏松、脱落，摄食及活动明显减少，精神萎靡，蜷缩、消瘦，呼吸急促等虚损症状，甚至死亡。南亚昀等[18]给予大鼠150 mg·kg-1腺嘌呤混悬液灌胃，30天后大鼠出现体重下降、弓背蜷缩、反应迟钝、体毛稀疏、畏寒、并失去光泽等表现。这是因为腺嘌呤的代谢产物会引起肾衰，其产物毒性还会影响肾组织的能量代谢，进而出现一系列的阳虚表现。现将各种药物造模的机制、具体应用方法、模型表现及特点与不足整理(表1)。

表1 药物造模的方法、机制、模型表现及特点与不足

2.1.2 手术造模

手术造模的机制均为切除器官以抑制相应的下丘脑-垂体-靶腺轴，使动物体表现出肾阳虚的症状。

例如，吕银娟等[19]切除了大鼠双侧3/4肾上腺，4周后出现精神不振、活动减少、体毛稀疏、干枯无光泽等表现，且体温和尿17-羟皮质类固醇(尿17-OHCS)含量均显著降低；卢德赵等[20]通过切除双侧甲状腺，使大鼠表现出肾阳虚的症状，且有甲状腺激素水平的下降；吴月国等[21]切除了大鼠的双侧睾丸，大鼠出现活动量减少，体重明显减轻等表现，并伴有性激素的水平下降。将手术造模的机制、具体应用方法、模型表现及特点与不足整理(表2)。

表2 手术造模的方法、机制、模型表现及特点与不足

2.1.3 多因素造模

除单因素造模的方法外，还有学者利用多因素联合的方法建造肾阳虚模型。例如王郭琦等[22]利用1%腺嘌呤+1%地塞米松饲料喂养的方法建造模型，30天后出现了怕冷畏寒喜暖，生殖减退，体温降低，小便清长，蜷缩弓背，精神萎靡；血清睾酮(T)含量升高，游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)、总三碘甲状腺原氨酸(TT3)、总四碘甲状腺原氨酸(TT4)明显降低，尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)升高的特点；杨鉴冰等[23]利用地塞米松肌注+双侧卵巢切除的方法，诱导肾阳虚子宫发育不良模型；董兴刚等[24]通过切除单侧肾并注射阿霉素2次的方法建造肾阳虚的模型，但并未提及模型的表现。

2.2 中医病因造模

2.2.1 房劳模型

房劳过度，又称“肾劳”。是指房事太过耗伤肾精、肾气而致病。由于肾藏精，为封藏之本，肾精不宜过度耗泄。据此，有学者制备出“劳倦过度、房劳不节”肾阳虚雄性小鼠模型。李震等使小鼠频繁交配并强迫小鼠游泳，模拟房事不节、劳倦过度，诱发肾阳虚[25]。小鼠出现萎靡不振、畏寒怕冷、拱背少动等表现，其睾丸、胸腺重量、睾丸组织乳酸脱氢酶(LDH)总活性及乳酸脱氢同工酶X(LDH-X)相对活性都明显降低。

2.1.2 老年大鼠模型

也有学者选择年老的大鼠等作为肾阳虚模型。《实验动物与实验动物模型》中提出，若将人类的60岁作为老年的标准，老年大鼠应为1.7岁，小鼠为1.3岁，狗为10岁，豚鼠则为4.8岁。例如丁克祥等人利用2-3月龄的小鼠模拟年老模型进行实验[26]。

2.1.3 恐伤肾模型

在中医理论中，肝在志为怒，心在志为喜，脾在志为思，肺在志为忧，肾在志为恐。根据七情内伤的理论，沈雁等用猫吓鼠、人吓猫、爆竹吓狗的方法进行造模[27]。

3 评价标准

3.1 宏观表征

肾阳虚证临床以畏寒肢冷，腰膝以下尤甚，面色晄白或黧黑，小便清长，夜尿多，舌淡苔白，脉弱等为主要表现。文献中当实验动物出现爪甲与耳廓颜色变淡、体毛枯疏并失去光泽、活动减少、反应迟钝、弓背蜷缩、喜扎堆等畏寒怕冷表现，食量及饮水量减少，体温及体质量显著下降等表现时[19,28-30]，即评价造模成功。

3.2 微观指标

肾阳虚动物模型中常有以下指标的改变，如：环磷酸腺苷(cAMP)含量下降，环磷酸鸟苷(cGMP)含量升高，cAMP/cGMP比值降低[28,31]；血清三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)水平明显下降，促甲状腺激素释放激素(TSH)含量减少[32,33]；雄鼠血清T含量减少、雌鼠血清雌二醇(E2)含量减少，精子计数明显减少，活动精子百分率显著降低，且畸形精子百分率明显升高[34]；尿17-OH-CS含量减少[19]；睾丸、附睾、胸腺、脾等脏器指数降低，肾脏、睾丸等组织也会出现相应的病理改变，例如肾小球及间质内炎细胞浸润、肾小球坏死、睾丸中生精细胞变性或坏死脱落等[35]。现将肾阳虚模型动物常见的微观指标整理(表3)。这些微观指标的变化虽表现在不同动物中，但仍不能全面概括肾阳虚本质的表现。

表3 肾阳虚动物模型微观指标的评价

3.3 反证方剂

方剂反证是验证模型成功与否的必要条件，用来反证肾阳虚模型主要有药物和方剂2种。药物主要包括白附子[36]、菟丝子[37]、淫羊藿[38]、覆盆子[39]、山茱萸[40]等；反证方剂主要有加味五子衍宗丸[41]、金匮肾气丸[28]、右归丸[25]、七宝美髯丹[43]、二仙汤[38]等；反证的方式还包括针刺[44]与艾灸[45]。这些药物与方剂均有温肾助阳的作用，因此可以改善模型动物的肾阳虚症状，以及实验室指标，进而判定模型建造成功。

4 讨论

4.1 造模方法

现今学术界常用的肾阳虚造模方法可分为病因造模与病理造模两方面，病理造模主要分为药物造模、手术造模与多因素联合造模；病因造模主要为根据中医病因模拟肾阳虚，包括房劳模型、恐伤肾模型、老年动物模型。

药物造模中包括糖皮质激素、抗甲状腺药物、性激素、腺嘌呤、羟基脲等，其中糖皮质激素、抗甲状腺药物、性激素3种药物的作用机制为模拟下丘脑-垂体-靶腺轴(肾上腺、甲状腺、性腺)受抑制时的病理状态，从而使动物产生类似“肾阳虚”的虚损症状。其优点在于操作简单且易于控制，成本低，成模时间短，多为1周至3周。而且应用此类药物时能良好的相应靶腺轴受抑制的疾病状态，特异性强。例如当研究与生殖相关疾病时，苏洁等[46]通过雌二醇腹腔注射的方法，使大鼠表现出明显的生殖机能下降。张文钊等[47]以25 mg·kg-1的剂量给予大鼠肌肉注射，15天后大鼠出现肛温降低、大便溏薄等“寒象”以及肾上腺、下丘脑、垂体脏器指数的降低；但其不足也在于只能反映单一靶腺轴受抑制的病变，例如，欧阳轶强等[48]在应用他巴唑这种抗甲状腺药物造模的时候，大鼠出现了明显的体温下降和血清中T3、T4的下降，但肾上腺轴、性腺轴的改变不明显。且在使用糖皮质激素肌注造模时，经常出现注射部位的溃烂[49]，动物体的损伤也会对动物的状态以及机能造成影响。并且，氢化可的松也是建造肾阴虚模型的常用药物[50]，在两种模型造模方法中的不同通常在于肾阴虚的给药时间更长，但两种模型的给药时间没有明确的界限。因此虽然糖皮质激素肌注造模是现今最常用的模型，但仍然有许多需要解决的问题。腺嘌呤灌胃造模也是经常使用的造模方法，但其存在着药物剂量大、造模时间长的问题，而且腺嘌呤在体内黄嘌呤氧化酶的作用下转变成极难溶解于水的2,8-二羟基腺嘌呤，该产物会沉积于肾小管引起肾衰，造成动物的死亡。

手术造模也是通过抑制靶腺轴来模拟肾阳虚的症状，虽然其操作简单，但对动物体伤害较大，且不可逆，容易造成动物的死亡。复合因素造模的动物模型虽然可以从多个方向复制模型，使其反应的“肾阳虚”症状更加全面，但操作略复杂。

中医的病因造模可以很好的复制因肾阳虚引起的“虚寒”症状，与西医的病理造模相比更符合中医病因，且兼夹证候少。但病因造模也存在着一定的问题，例如惊恐伤肾和房劳伤肾的模型所需的动物数量太多，房劳的模型需要多只雌鼠配合，恐伤肾中的猫吓鼠模型，每天需要老鼠喂猫，增加了动物模型的消耗，成本过高。对于老年大鼠而言，年老的动物模型至今仍无统一的年老标准，受客观因素的影响也较大。生物体发展到老年的时候也伴随着各个系统的老化，并不单纯是肾阳虚，在中医理论中，衰老更多属于肾精的亏虚，因此将老年动物等同于肾阳虚并不标准。

4.2 评价标准

就评价标准而言，现有的动物实验大多通过行为学特征、生化标准和反证方剂来判断所造成的模型是否成功。3方面应互相结合来判断模型是否成功，但大多文献中只对动物的行为学表现做出了描述，当动物出现毛发竖起且无光泽，精神萎靡，饮食量下降，体质量明显降低等症状时即表明造模成功，未进一步结合理化指标。这样存在的问题在于，单从外在来看，精神萎靡、饮食量下降、畏寒等症状并不是肾阳虚所独有，比如脾阳虚证和肾阳虚证的症状表现就存在较大交叉性[51]，因此评价模型成功的标准并不严谨。而且症状和体征依赖于主观评价，难免造成主观上的偏倚。且很少有实验研究能够结合中医特色的舌脉观察，对于小鼠此类小型动物来说观察舌脉也具有一定困难，如何将中医更好的结合到诊断中也是值得思考的问题。

对于微观指标来说，现今评判“肾阳虚”的指标均过于普遍。例如，与肾脏功能相关的研究选取皮质醇(CORT)、肌酐(Cr)；与生殖机能相关则选取睾酮(T)、雌二醇(E2)；此外还有与甲状腺机能减退相关的甲状腺激素等，此类指标并未有与肾阳虚的密切关联。除此之外，还有很多实验将肾脏或生殖器官的病理变化作为肾阳虚的评价标准，但生物体作为一个整体，疾病的发生都会造成某些器官的病理变化。因此，这些指标的选取在某种程度上与肾阳虚并不具有特异性。而且更多的文献中并没有对建立的动物模型行为学表现的描述，或微观指标改变的叙述，甚至没有对动物模型进行评价[52,53]。因此，指标的选取应该更加贴近于临床，选取在临床试验中具有代表性的肾阳虚指标在动物体上进行评价。

笔者在总结文献时也发现，利用反证方剂来评价模型也是常用的方法，但也存在着一些问题。例如李耿[54]在验证通过氢化可的松建立的肾阳虚模型时应用了六味地黄丸和知柏地黄丸，但这两个方剂是用来治疗肾阴虚的常用方。且应用后小鼠“肾阳虚”的症状有所好转，这是否说明利用氢化可的松建造的“肾阳虚”模型不一定真的能够反应肾阳虚的本质？因此造模方法及评价标准还需要进一步明确。

4.3 模型动物

用于肾阳虚造模的动物种类繁多，虽然大鼠小鼠因其体型小、易饲养、易操作的特点被广泛应用，但模型的选择也与所研究的疾病有一定的关联。例如，当研究肾阳虚所致的水肿或者多尿疾病时经常使用大鼠模型[55,56]；变应性鼻炎的肾阳虚证经常使用豚鼠作为研究动物[57]；此外，衰老模型[58,59]也经常被使用。小型的哺乳动物虽然存在优势，但仍存在问题，比如中医体系中特有的舌象、脉象信息很难收集，但这些资料在大型的哺乳动物上采集就较为容易，而且大型的哺乳动物与人类更为接近，因此可以尝试在小型猪等大型的哺乳动物上进行肾阳虚相关的研究。