择时针刺对炎性疼痛模型P2X7-/-小鼠穴区成纤维细胞p38MAPK表达的影响＊

刘 祎，景明夷，白艾灵，韦 婷，蔡定均

(成都中医药大学针灸推拿学院 成都 610036)

择时针刺是广受关注的一种针刺疗法，其效应与穴位局部结构及功能状态变化密切相关[1]。穴位区域成纤维细胞可感知针刺等机械刺激并将其转换为机体可识别的生物信号，继而引发多种生物学效应[2-4]。不同时间针刺穴区成纤维细胞出现的变化不一。我们前期研究发现，在ZT0(7：00)、ZT4(11：00)、ZT8(15：00)、ZT12(19：00)、ZT16(23：00)、ZT20(3：00)时间点针刺足三里穴，穴区成纤维细胞横截面积增大，呈圆梭形排列，骨架重构不同，其中以ZT8最明显[5]。ZT8时间点针刺穴区成纤维细胞发生改变的同时，其细胞膜上P2X7受体也发生明显变化[6]。MAPK相关信号通路被证明在细胞骨架中的微管、微丝和中间纤维等结构的调节中发挥重要作用[7-10]，p38MAPK及其磷酸化改变是其中的关键环节之一。在经典炎性疼痛模型下，我们已证明ZT8时间点针刺可调节野生型小鼠穴区p38MAPK表达量[6]，故本实验选用P2X7-/-小鼠建立炎性疼痛模型，观察ZT8针刺足三里对穴区p38MAPK表达的影响，以明确P2X7受体是否通过p38MAPK信号通路介导择时针刺对成纤维细胞骨架的重构。

1 材料

1.1 动物

P2X7-/-小鼠18只，雌雄皆可，体质量20±2 g，10-14周龄，自JAX实验室引进，购买于北京维通利华实验动物技术服务公司。实验在成都医学院SPF级实验室进行，每Optimice 100 EVC笼具内饲养5-7只动物。自动光－暗控制[L:D为12:12，即07:00-19:00光照(light，L)，19:00-07:00暗置(dark，D)]，笼具内隔音、通风、恒温(22-24℃)，相对湿度50%-60%。所有动物均饲以SPF级颗粒饲料与灭菌水，并由成都医学院实验动物中心提供。

1.2 试剂

ECL发光试剂盒(批号：BL520A，美国Thermo公司)，预染蛋白Marker(批号：00215343，美国NEB公司)，PVDF膜(美国Hybond公司)。P38抗体、兔单克隆抗体(批号：ab32142)，β-actin抗体、鼠单克隆抗体(批号：ab8226)，生物素化山羊抗鼠IgG(H+L)(批号：ab6789)，生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(批号：ab6721)，以上抗体皆购买于Abcam艾博抗(上海)贸易有限公司。

2 方法

2.1 动物筛选

所有动物经过7天光-暗周期同步驯化后，选用与光-暗周期同步的动物，采用辐射热甩尾法在上午8点到12点间测定痛阈。具体方法：先安抚动物，待其情绪平稳后将其放入自制的圆桶型小鼠固定器中，头部向前，使尾巴充分暴露并自然放松。待动物完全安静后，将尾巴的中下三分之一处平放在疼痛甩尾测试仪(7360型，意大利Ugo Basile)的光热辐射孔上，然后点击测试键，记录该孔中开始发出热刺激直接照射到动物尾部皮肤到动物尾巴主动甩开的这段时间，即为甩尾反应潜伏期。同一只动物测定时间间隔在5 min以上，以防动物被烫伤或者被激怒。操作过程由固定人员在同一室内环境(室内温度保持在22-24℃，相对湿度为50%至60%之间)下进行，最终痛阈值以3次测定值的平均数为准。

痛阈筛选标准：在3-10 s内动物能产生甩尾反应即纳入实验；甩尾时间低于3 s或高于10 s的动物剔除实验，表明此类动物出现痛觉过敏或反应迟钝。

2.2 实验分组

动物筛选完成后，运用SPSS21.0统计软件根据痛阈值完全随机分组，分为空白组6只、造模组12只。造模组模型复制完成后，使用相同统计软件据痛阈值将12只动物随机分为模型组6只、模型+针刺组6只。

2.3 模型复制

分组完成以后，在造模组动物的右足足垫部皮内注射完全弗氏佐剂20μL。空白组动物于相同部位注射剂量相当的生理盐水。处理结束24 h后，能够看到造模动物注射的右足区域出现明显的红肿(图1)，造模组动物通过疼痛甩尾仪检测到的痛阈潜伏期相对造模前显著缩短，说明造模组右足部进入急性炎症疼痛阶段，提示造模成功。

图1 造模成功图

2.4 时间点选择

ZT表示授时因子(Zeitgeber)，本次实验中ZT0为开灯时间(7：00)，ZT12即关灯时间(19：00)。依据前期相关实验研究结果[5]，本次实验选用ZT8(15:00)特定时间点进行动物处理。

2.5 动物处理

各组动物在相同时间点进行处理，处理方法如下：

2.5.1 模型+针刺组(下文简写作模针组)

操作前先以自制圆桶型固定器固定好动物，然后选用13 mm毫针针刺右侧足三里穴，针刺深度约3 mm，每5 min采用捻转法行针1次，每次行针1 min，频率为120次/min，共留针30 min。每天1次，连续处理7天。足三里定位参照《实验针灸学》[11]，位于膝关节后外侧，在腓骨头下约0.3 cm处的肌沟中。

2.5.2 模型组

在模针组动物接受针刺处理的同一时间内，模型组使用同一固定器及同样的固定方式固定动物30 min，不进行其他处理。

2.5.3 空白组

在模针组动物接受针刺处理的同一时间内，空白组使用同一固定器及同样的固定方式固定动物30 min，不进行其他操作处理。

2.6 取材

在第7天针刺结束后，采取颈椎脱臼法处死动物，立即取足三里穴区皮肤及皮下组织(面积约2 mm*2 mm，深度为2-3 mm)，用5 cm*5 cm的锡箔纸包装好后立即置于-80℃液氮瓶中冰冻储存。

2.7 指标检测

P2X7-/-小鼠穴区成纤维细胞p38MAPK基因的表达：提取样本总RNA后，进行除去反应(表1)和逆转录反应(表2)。本研究所用引物及碱基序列如下所示(表3)：

表1 DNA去除反应体系

表2 逆转录反应体系

表3 本次检测所用引物及碱基序列

实时荧光定量PCR反应(表4、表5)结束后进行计算分析，使用Thermo Scientific PikoReal软件(Thermo公司)分析PCR过程各检测样本的Ct(Threshold cycle)值。本实验通过2-ΔΔCT计算X相对mRNA表达水平 ：ΔCTintervention= CTintervention 目 的 -CTintervention内参，ΔCTblank=CTblank目的-CT blank-内参，ΔΔCT=ΔCT intervention-ΔCT blank，XmRNA表达差别倍数以2-ΔΔCT表示。

表4 PCR反应体系

表5 PCR反应程序

P2X7-/-小鼠穴区成纤维细胞p38MAPK蛋白的表达：提取穴区皮肤组织样本后，采用BCA法测定样本蛋白浓度，将完成转膜、封闭后的PVDF膜放入一抗中，(一抗浓度：P38 1:2000；β-actin 1:5000)，4℃孵育过夜，用TBST将PVDF膜洗3次，每次5 min；然后放入二抗(稀释浓度：1∶5000)中，室温孵育2-3 h；用TBST将PVDF膜洗3次，每次10 min。而后使用ECL发光试剂盒将A、B两种发光液进行等体积混合，然后均匀的滴至膜上，反应1 min后去残液，进行曝光。最后进行图像解析，结果表示为目标蛋白的相对表达量。

2.8 统计方法

采用SPSS21.0统计软件进行统计分析。数据以±s表示，多样本均数间比较采用One-Way ANOVA检验，方差齐则采用LSD检验，方差不齐则采用Tamhane’s T2检验，检验结果以P＜0.05时认为其组间差异有显著性。

3 结果

3.1 择时针刺后P2X7-/-小鼠穴区成纤维细胞p38MAPK基因的表达

模型组小鼠穴位皮肤及皮下组织中p38MAPK基因与空白组相比，其表达升高，有统计学意义，P＜0.05；与模型组相比，模针组小鼠穴位皮肤及皮下组织中p38MAPK基因表达降低，有统计学意义，P＜0.05(表6、图2)。

图2 A：p38MAPK扩增曲线图；B：p38MAPK溶解曲线图

表6 P2X7-/-小鼠穴位皮肤及皮下组织中p38MAPK mRNA的表达变化(±s)

表6 P2X7-/-小鼠穴位皮肤及皮下组织中p38MAPK mRNA的表达变化(±s)

注：模型组对比空白组，#P＜0.05，模针组对比模型组，*P＜0.05。

组别空白组模型组模针组样本数量(例)6 6 6 2-ΔΔCT(基因表达值)1.043±0.357 3.497±1.497#1.290±0.846*

3.2 择时针刺后P2X7-/-小鼠穴区成纤维细胞p38MAPK蛋白的表达

模型组小鼠皮肤组织中P38蛋白较空白组，表达明显升高，存在显著统计学差异，P＜0.01；与模型组相比，模针组小鼠皮肤组织中P38蛋白表达量降低，有显著统计学意义，P＜0.05(表7、图3)。

表7 各实验组小鼠皮肤组织中P38MAPK蛋白表达量(±s)

表7 各实验组小鼠皮肤组织中P38MAPK蛋白表达量(±s)

注：模型组与空白组相比，**P＜0.01；模针组与模型组相比，△P＜0.05。

组别空白组模型组模针组送检标本(例)6 6 6蛋白相对表达量1.0010±0.0510 1.4153±0.3144**1.1151±0.1823△

图3 足三里穴区皮肤组织中p38MAPK蛋白表达量

4 讨论

针刺效应具有时间特异性，不同时间点针刺所产生的临床疗效不同。在《黄帝内经》中就已经提出了针刺须“逢时候气”，《灵枢·四时气》篇指出“四时之气，各有所在”，即季节有异，“灸刺之道，得气穴为定”，故而针刺方法也应有所不同。在现代临床研究中，也运用了许多择时针刺的治疗方法，并取得良好的疗效。在治疗经前期综合征中，梁洁莎等[12]将子午流注开穴法与中药结合，取得显著疗效；在治疗IBS-D中，研究者[13]采用飞腾八法定时取穴，与常规取穴针刺组比较，发现其疗效更优，并更大程度上改善了患者生活质量；在观察脑卒中后昼间嗜睡的远期疗效中，研究人员[14]发现醒脑开窍法联合灵龟八法针刺治疗，结果与对照组相比更具优势。同时，我们也观察到针刺镇痛具有一定的时相特征，沈晓炜[15]在ZT0(07：00)到ZT20(03：00)时间段内等分的6个时间点中，分别针刺炎性疼痛模型大鼠足三里穴，实验发现针刺后大鼠痛阈值皆出现上升，但反应强弱存在时间差异，其反应曲线呈现单峰一谷结构，在ZT8(15：00)时间点所表现的经穴反应性最佳，而ZT16(23：00)时间点反应最差。

在前期研究中，我们通过激光共聚焦显微镜观察发现，ZT8时间点针刺炎性疼痛模型下的野生型小鼠，其穴区成纤维细胞排列的形态更加规整[6]，细胞骨架重构明显，横截面积增大，均匀分布在细胞核四周，细胞间骨架交织成网状，穴区维持细胞形态的骨架蛋白F-actin及微管蛋白β-tubulin的表达明显高于空白组和模型组；而P2X7-/-小鼠各组成纤维细胞排列变化不大，细胞骨架重构不明显，F-actin、β-tubulin的表达远远不及野生型小鼠，成纤维细胞分布的数量也更少，这可能与P2X7受体的缺失有关。因此，择时针刺对穴区成纤维细胞骨架的重构可能与细胞膜上P2X7受体密切相关。

为了进一步观察该受体是如何发挥作用的，我们聚焦于MAPK相关信号通路。MAPK是一组广泛分布的丝/苏氨酸蛋白激酶，p38MAPK被认为是细胞骨架稳定性的调节因子［16,17]。倪永梁[18]研究证实调亡蛋白Bax和cleaved-caspase 3诱导足细胞的凋亡与P38蛋白磷酸化的上调有关，并且P38蛋白磷酸化参与下调骨架调节蛋白synaptopodin表达来引起F-actin细胞骨架改变。P38MAPK还与口腔内成纤维细胞机械力的跨膜信号转导及其内部压力值变化有关[19]。细胞形态变化和骨架重构是局部组织响应外界作用力的重要环节，也是穴区响应针刺信号的关键结构，p38MAPK在其中扮演重要角色。我们前期研究亦发现，针刺对穴区p38MAPK表达量有明显的调节作用[6]。因此，本实验提出假设，P2X7受体可能是通过p38MAPK信号通路介导择时针刺对成纤维细胞骨架的重构。实验结果显示，在P2X7-/-小鼠上建立炎性疼痛模型，选择ZT8(15：00)针刺后测定穴区p38MAPK的mRNA和蛋白表达量，模型组小鼠p38MAPK蛋白表达量相对空白组升高，模针组小鼠皮肤组织中p38MAPK蛋白表达量相对于模型组降低。P38MAPK信号通路是介导细胞力信号传导的重要途径，可因一些炎性细胞因子及局部渗透压改变等激活，故模型组p38MAPK表达明显上升。已有研究表明[20]，针刺可通过抑制皮肤组织p38MAPK的表达来阻止胶原裂变及细胞外基质成分降解而起到抗皮肤衰老的作用，p38MAPK又是细胞骨架稳定性的调节因子，因此模针组p38MAPK表达的降低可能与针刺后穴区成纤维细胞骨架的重构密切相关。结合前期野生型小鼠针刺后p38MAPK的mRNA和蛋白表达量变化[6]来看，本次敲除P2X7受体基因后，择时针刺信号对p38MAPK表达的影响仍然存在，与针刺野生型小鼠产生的变化一致。由此可知，在择时针刺影响成纤维细胞骨架重构的效应中，P2X7受体并非通过对p38MAPK的调整以发挥作用，或者说不单纯由此通路介导产生，可能还与局部骨架蛋白表达相关信号分子HSP27、P-Op18/stathmin等含量变化有关[21]。

本次研究选择将基因敲除小鼠作为研究对象，观察择时针刺时，穴区成纤维细胞形态改变与P2X7受体对p38MAPK表达影响的关系，研究结果有助于阐释择时针刺的穴位局部启动效应及机制。今后我们将继续关注择时针刺后穴区成纤维细胞形变的下游信号并开展深入，以期更好的揭示择时针刺的穴位局部启动机制。