CD34、podoplanin与子宫颈癌细胞增殖、血管内皮生长因子的关系及对预后的影响

聂美楠

【摘要】 目的：探究CD34、podoplanin与子宫颈癌细胞增殖、血管内皮生长因子的关系及对预后的影响。方法：选取2015年5月-2017年5月本院子宫颈癌患者106例，均行手术切除治疗，留取子宫颈癌组织与癌旁正常组织标本。比较子宫颈癌组织与癌旁正常组织CD34、podoplanin表达情况，分析子宫颈癌组织中CD34与podoplanin的相关性，并对比不同CD34、podoplanin表达子宫颈癌组织增殖基因（Derlin1、SFRP2、TUG1、PRPS2）、血管内皮生长因子[血管内皮生长因子（VEGF）-A、VEGF-C、VEGF-D、血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）]水平，分析CD34、podoplanin与增殖基因、血管内皮生长因子的关系。随访3年，统计分析患者3年生存率。结果：子宫颈癌组织CD34、podoplanin阳性表达率、表达量均高于癌旁组织（P<0.05）。子宫颈癌组织中CD34表达量与podoplanin表达量存在正相关关系（P<0.05）。CD34强阳性子宫颈癌组织Derlin1、TUG1、PRPS2表达量高于弱阳性子宫颈癌组织，SFRP2低于弱阳性子宫颈癌组织（P<0.05）;podoplanin阳性子宫颈癌组织Derlin1、TUG1、PRPS2表达量高于阴性子宫颈癌组织，SFRP2低于阴性子宫颈癌组织（P<0.05）;CD34强阳性子宫颈癌组织VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表达量高于弱阳性子宫颈癌组织（P<0.05）;podoplanin阳性子宫颈癌组织VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表达量高于阴性子宫颈癌组织（P<0.05）。子宫颈癌组织CD34、podoplanin与Derlin1、TUG1、PRPS2、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3均存在正相关关系，与SFRP2存在负相关关系（P<0.05）。CD34强阳性患者3年生存率低于弱阳性者，podoplanin阳性患者3年生存率低于阴性者（P<0.05）。结论：子宫颈癌组织CD34、podoplanin表达水平与子宫颈癌细胞增殖基因表达、血管内皮生长因子间存在相关性，且CD34、podoplanin陽性表达可降低患者生存率，早期检测其表达情况有助于评定子宫颈癌预后。

【关键词】 子宫颈癌 CD34 podoplanin 细胞增殖 血管内皮生长因子 生存率

Relationship between CD34， podoplanin and Cervical Cancer Cell Proliferation， Vascular Endothelial Growth Factor and Their Influence On Prognosis/NIE Meinan. //Medical Innovation of China， 2021， 18（13）： 0-028

[Abstract] Objective： To explore the relationship between CD34， podoplanin and cervical cancer cell proliferation， vascular endothelial growth factor and their influence on prognosis. Method： A total of 106 cervical cancer patients in our hospital from May 2015 to May 2017 were selected， all of whom underwent surgical resection， and specimens of cervical cancer tissues and adjacent normal tissues were retained. The expression of CD34 and podoplanin in cervical cancer tissue and normal tissue adjacent to the cancer were compared， and the correlation between CD34 and podoplanin in cervical cancer tissue was analyzed. And the different CD34， podoplanin expression of cervical cancer tissue proliferation genes （Derlin1， SFRP2， TUG1， PRPS2）， vascular endothelial growth factor [vascular endothelial growth factor-A （VEGF-A）， VEGF-C， VEGF-D， vascular endothelial growth factor receptor 3 （VEGFR-3）] levels were compared. The relationship between CD34， podoplanin， proliferation genes and vascular endothelial growth factor was analyzed. Followed up for 3 years， the 3-year survival rate was statistically analyzed. Result： The positive expression rates and levels of CD34 and podoplanin in cervical cancer tissues were higher than those in adjacent tissues （P<0.05）. There was a positive correlation between the expression of CD34 and podoplanin in cervical cancer tissues （P<0.05）. The expression levels of Derlin1， TUG1 and PRPS2 in CD34 strongly positive cervical cancer tissues were higher than those in weakly positive cervical cancer tissues， and SFRP2 was lower than weakly positive cervical cancer tissues （P<0.05）; the expression levels of Derlin1， TUG1 and PRPS2 in podoplanin-positive cervical cancer tissue were higher than those in negative cervical cancer tissue， and SFRP2 was lower than that in negative cervical cancer tissue （P<0.05）; the expression levels of VEGF-A， VEGF-C， VEGF-D， and VEGFR-3 in CD34 strongly positive cervical cancer tissues were higher than those in weakly positive cervical cancer tissues （P<0.05）; the expression levels of VEGF-A， VEGF-C， VEGF-D and VEGFR-3 in podoplanin-positive cervical cancer tissues were higher than those in negative cervical cancer tissues （P<0.05）. CD34， podopranin and Derrin1， Tug1， PRPS2， VEGF-A， VEGF-C， VEGF-D and VEGFR-3 were positively correlated with cervical cancer tissues， and there was a negative correlation with SFRP2 （P<0.05）. The 3-year survival rate of CD34-positive patients was lower than that of weak-positive patients， and the 3-year survival rate of podoplanin-positive patients was lower than that of negative patients （P<0.05）. Conclusion： The expression levels of CD34 and podoplanin in cervical cancer tissues are correlated with the expression of proliferation genes and vascular endothelial growth factor in cervical cancer cells. Moreover， the positive expression of CD34 and podoplanin can reduce the survival rate of patients， and early detection of the expression of CD34 and podoplanin is helpful to evaluate the prognosis of cervical cancer.

[Key words] Cervical cancer CD34 podoplanin Cell proliferation Vascular endothelial growth factor

Survival rate

First-authors address： Hong Da Hospital of Jiamusi University， Jiamusi 154002， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.13.006

子宫颈癌是全球范围内女性第二大恶性肿瘤，每年可导致26万人死亡，我国当前子宫颈癌的发生率逐渐增高，且呈现年轻化趋势，早期确诊疾病、明确病情是当下该病治疗结局优化的关键环节[1-2]。转移和侵袭是恶性肿瘤的基本特征，子宫颈癌尤以淋巴转移为主，是导致患者死亡的主要原因[3]。近年来研究发现，podoplanin是一个特异性表达于淋巴管内皮的分子，被认为是淋巴管内皮特异性标记物，具有促进肿瘤淋巴管形成的作用，且与肿瘤预后密切相关[4]。CD34是一种血管标记物，其阳性表达可刺激肿瘤组织中脉管的增加，促进肿瘤的转移、浸润[5-6]。但目前关于CD34、podoplanin在子宫颈癌组织中表达情况的研究较少，其具体应用价值尚未明确。基于此，本研究尝试探究CD34、podoplanin与子宫颈癌细胞增殖、血管内皮生长因子的關系及对预后的影响，旨在探寻子宫颈癌靶向治疗的新途径。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年5月-2017年5月本院子宫颈癌患者106例，纳入标准：符合子宫颈癌诊断标准[7]，并经术后病理诊断确诊;病理分型均为鳞癌;入组前未接受手术、放化疗治疗;首次确诊;自主行为能力良好，能配合完成研究。排除标准：合并其他恶性肿瘤;严重感染性疾病;血液系统疾病;严重心脑血管疾病;既往有宫颈手术史;入组前6个月内有严重创伤或手术史;自身免疫性疾病;妊娠期或哺乳期女性。年龄40～78岁，平均（61.28±8.35）岁;体质量指数（body mass index，BMI）19.5～28.1 kg/m2，平均（25.12±1.45）kg/m2;绝经情况：绝经82例，未绝经24例;合并症：冠心病15例，高血压21例，糖尿病12例，高血脂17例;临床分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期42例，Ⅲa期41例;有淋巴结转移者35例。所有患者及家属均知情同意并签署知情同意书，且本研究已经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 CD34、podoplanin表达检测 所有患者均行手术切除治疗，留取子宫颈癌组织与癌旁正常组织标本，采用中性福尔马林液中固定保存，常规进行脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，4 μm厚连续切片，采用MY-AU60型全自动免疫组化染色仪[生产厂家：上海永创医疗器械有限公司，批准文号：沪食药监械（准）字2014第1400017号]，以免疫组化发检测子宫颈癌组织与癌旁正常组织CD34、podoplanin表达情况，免疫组化染色试剂盒购自上海长岛生物技术有限公司[批准文号：沪食药监械（准）字2011第1400917号，规格：300人份]，用磷酸盐缓冲液[生产厂家：上海长岛生物技术有限公司，批准文号：沪食药监械（准）字2013第1401159号，规格：浓缩液1×50 mL]代替一抗作阴性对照。于高倍显微镜下（倍数10×40）进行结果判定，随机选取5～10个高倍视野，每个视野计数100个瘤细胞，计数阳性细胞百分比。按着色细胞百分比分级，无着色细胞或<10%为阴性（-），阳性细胞数10%～25%为弱阳性（+）;阳性细胞数26%～50%为阳性（++）;阳性细胞数>50%为强阳性（+++）。于低倍显微镜下（倍数10×10）下寻找癌灶内部和癌灶边缘组织阳性淋巴管密集区域，高倍镜下观察并计数，以5个高倍镜视野中阳性脉管的平均数表示。

1.2.2 子宫颈癌组织增殖基因检测 采用实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术监测子宫颈癌组织增殖基因表达量，包括Derlin1、SFRP2、TUG1、PRPS2，设置宫颈正常组织中上述基因表达量为标准值，计算子宫颈癌组织增殖上述基因的相对表达量。

1.2.3 血管内皮生长因子水平检测 切取适量子宫颈癌组织30 mg，加入200 μL磷酸盐缓冲液，充分匀浆后离心分离上层澄清液，置于-70 ℃冷藏室保存，采用酶联免疫吸附试剂盒测定血管内皮生长因子水平，包括血管内皮生长因子（vascular epithelial growth factor，VEGF）-A、VEGF-C、VEGF-D、血管内皮生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3），试剂盒购自辽宁迈迪生物科技有限公司，检测操作均由专业人员严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 观察指标 （1）子宫颈癌组织与癌旁正常组织CD34、podoplanin表达情况。（2）分析子宫颈癌组织中CD34与podoplanin的相关性。（3）不同CD34、podoplanin表达子宫颈癌组织增殖基因（Derlin1、SFRP2、TUG1、PRPS2）、血管内皮生长因子（VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3）水平。（4）分析CD34、podoplanin与增殖基因、血管内皮生长因子的关系。（5）随访3年，统计分析患者3年生存率，并比较不同癌旁正常组织CD34、podoplanin表达患者的3年生存率。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料采用Bartlett方差齐性检验与Kolmogorov-Smirnov正态性检验，均确认具备方差齐性且近似服从正态分布，用（x±s）表示，比较采用独立样本t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。相关性分析采用Pearson相关系数模型。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫颈癌组织与癌旁正常组织CD34、podoplanin表达情况比较 子宫颈癌组织CD34、podoplanin阳性表达率与表达量均较癌旁组织高（P<0.05），见表1。其中CD34将微血管内皮染为棕黄色（见图1a）;podoplanin阳性染色主要位于肿瘤淋巴内皮细胞胞浆，为棕褐色颗粒，呈弥漫性分布（见图1b）。

2.2 子宫颈癌组织中CD34与podoplanin相关性 Pearson相关性分析，子宫颈癌组织中CD34表达量与podoplanin表达量呈正相关（r=0.701，P<0.05），见图2。

2.3 不同CD34、podoplanin表达子宫颈癌组织细胞增殖情况 CD34强阳性子宫颈癌组织Derlin1、TUG1、PRPS2表达量均较弱阳性子宫颈癌组织高，SFRP2较弱阳性子宫颈癌组织低（P<0.05）;podoplanin阳性子宫颈癌组织Derlin1、TUG1、PRPS2表达量均较阴性子宫颈癌组织高，SFRP2较阴性子宫颈癌组织低（P<0.05）。见表2。

2.4 不同CD34、podoplanin表达子宫颈癌组织血管内皮生长因子表达水平 CD34强阳性子宫颈癌组织VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表达量均较弱阳性子宫颈癌组织高（P<0.05）;podoplanin阳性子宫颈癌组织VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表达量均较阴性子宫颈癌组织高（P<0.05），見表3。

2.5 子宫颈癌组织CD34、podoplanin与细胞增殖、血管内皮生长因子相关性 Pearson相关性分析，子宫颈癌组织CD34、podoplanin与Derlin1、TUG1、PRPS2、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3呈正相关，与SFRP2呈负相关（P<0.05），见表4。

2.6 不同CD34、podoplanin表达者随访情况及生存情况比较 随访3年，失访5例。完成随访的101例子宫颈癌患者3年生存率为61.39%（62/101）。Kaplan-Meier生存曲线分析，CD34强阳性患者3年生存率46.05%（35/76）低于弱阳性者13.33%（4/30），podoplanin阳性患者3年生存率40.66%（37/91）低于阴性者13.33%（2/15）（字2=9.229、4.346，P=0.002、0.037）。

3 讨论

子宫颈癌的发生发展依赖血管形成，转移途径主要为直接蔓延和淋巴结转移，癌组织中微脉管的变化一直是近年国内外研究的热点[8-9]。

CD34是目前公认的血管标记物，作为一种高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，其选择性表达与人造血干细胞、血管内皮细胞及祖细胞表面[10]。林韵等[11]研究指出，CD34在肿瘤性小血管内皮细胞中表达增加，是与新生小血管密切相关的标记物。本研究发现，子宫颈癌组织CD34阳性表达率、表达量均高于癌旁组织，提示子宫颈癌病灶组织内微血管的生成与肿瘤的生长有密切关系。肿瘤微淋巴管系统的研究起步相对微血管较晚，主要在于缺少特异性标记物，使淋巴管的研究、发展受到限制[12]。随着对淋巴管的一些特异标记物的发现与鉴定，如podoplanin，给肿瘤研究开拓了新视野和新途径[13]。podoplanin是一种43 kD膜蛋白，具有控制足细胞形态的作用，其存在于淋巴管内皮细胞，且仅出现在小淋巴管，是较为理想的微淋巴管标记血管物[14-15]。国内相关报道显示，随着病变的加重，podoplanin阳性表达率逐步增加，有助于协助临床病理医师更快速地定位可疑浸润区，提升诊断效率[16]。本研究发现，子宫颈癌组织podoplanin阳性表达率、表达量均高于癌旁组织，且主要集中于癌灶边缘，podoplanin能特异性标记淋巴管，尤其毛细淋巴管，提示癌灶周边组织存在有功能的淋巴管，癌灶周边的癌细胞脱落进入淋巴管形成瘤栓，致瘤细胞发生转移。

本研究通过相关性分析发现，子宫颈癌组织中CD34表达量与podoplanin表达量间存在正相关关系，提示子宫颈癌病灶组织内的微血管与淋巴管的形成可能相互促进，可能是肿瘤增殖、浸润、转移的机制之一。此外，随着子宫颈癌组织CD34、podoplanin阳性表达增加，子宫颈癌组织Derlin1、TUG1、PRPS2及VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表达量随之升高，SFRP2表达量降低。其中Derlin1是调节内质网跨膜逆向转运的跨膜蛋白，具有拮抗内质网介导的细胞凋亡的作用，TUG1是一类能够拮抗p53活性的基因，具有抗细胞凋亡作用，可抑制肿瘤细胞凋亡，PRPS2可调节核苷酸合成、加速细胞周期进程，均为促进肿瘤增殖的基因，而SFRP2通过拮抗Wnt通路来抑制细胞增殖[17-18]。VEGF是目前已知促血管新生效应最强的细胞因子，包括VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D，能够与其受体VEGFR结合，发挥细胞生长、血管结构形成的作用[19]。笔者认为，CD34、podoplanin阳性表达与子宫颈癌的增殖、血管生成关系密切。本研究通过随访研究发现，CD34强阳性及podoplanin阳性患者3年生存率均较低，可能在于两者的阳性表达能促进肿瘤细胞增殖和微血管形成，从而促进疾病的生长、转移，增加病死率。

综上所述，子宫颈癌组织内CD34、podoplanin阳性表达明显升高，与子宫颈癌细胞增殖基因表达、血管内皮生长因子密切相关，且能降低患者3年生存率，早期检测其表达情况有助于临床制定治疗方案。本研究创新之处在于明确了CD34、podoplanin与子宫颈癌细胞增殖、血管内皮生长因子的关系及对预后的影响，后期研究中将进一步探究其在子宫颈癌靶向治疗方面的作用，充分发掘两者临床价值。

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（收稿日期：2020-08-19） （本文编辑：田婧）