各阶段母乳中维生素A含量测定与比较

陈 忱

北大荒完达山乳业股份有限公司质检中心，黑龙江哈尔滨 150000

0 引言

维生素A又名视黄醇，化学式C20H30O。维生素A是一种必需营养元素[1]，具有广泛的生理功能，包括参与视觉过程、细胞增殖和分化、细胞间信息交流、器官与组织的生长、生殖以及免疫系统功能[2，3]。目前，维生素A缺乏仍然是许多发展中国家所面临的一项重要的公共卫生问题，严重威胁着婴幼儿的生长发育[4]。

目前，关于母乳和牛乳中维生素A含量测定的方法最常用的是高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。相对于传统的比色法和苯并芘内标定量法，这两种方法都能更好的规避掉原有方法中分析法仪器配置复杂、灵活性差、分析时间太长，易造成维生素A回收率低的弊端。又由于超高效液相色谱-串联色谱法（HPLC-MS/MS）对于样品的前处理复杂，检测成本高，不利于广泛推广。因此，本文采用高效液相色谱法测定，此方法前处理简单、灵敏度高、易改进分离条件。

采用《GB 5009.82—2016食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定》（第一法食品中维生素A和维生素E的测定反向高效液相色谱法）进行牛乳及母乳在初乳期、过渡期和成熟期3个不同时期中维生素A的含量变化，并对数据进行比较分析，为婴幼儿配方乳粉母乳化提供相关技术参考。试样在前处理过程中先经皂化（含淀粉先用淀粉酶酶解）、提取、净化、浓缩后，再通过C18色谱柱反相液相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。

1 材料与方法

1.1 仪器与标准品

1.1.1 仪器

高效液相色谱：赛默飞UltiMate 3000；水浴磁力恒温搅拌器：METTLER TOLEDO生产MP220；分液漏斗萃取净化振荡器；旋转蒸发仪；氮吹仪；涡旋混合器：IKA VORTEX生产，型号GENIUS 3。

1.1.2 维生素A标准品

维生素A（C20H30O，CAS号：68-26-8）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质；维生素A储备液：浓度1.0mg/mL；维生素A工作液：浓度分别为2.5000μg/mL、5.0000μg/mL、10.0000μg/mL、15.0000μg/mL、20.0000μg/mL、25.0000μg/mL。

1.2 试剂

超纯水：Millipore纯水机制备；甲醇：SK生产，色谱纯；石油醚：科密欧生产，优级纯；2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）：科密欧生产，优级纯。

1.3 试验设计

1.3.1 母乳采集

《食品营养和检测》一书提到，维生素A含量在母乳中随着哺乳期时间变化而变化，根据人泌乳期分为初乳期（产后0～9天内）、过渡期（产后9～30天）、成熟期（2～5月）。母乳采样分为3组，每组进行10个不同样本测定[5]。

母乳的采集对象为产后0～12月健康产妇。以“知情自愿”为原则，乳母饮食均衡，奶水充足，无重大急慢性遗传传染病，无任何哺乳禁忌症[6]。

1.3.2 牛乳采集

选择来自北大荒完达山乳业股份有限公司天然有机牧场的10头处于初乳期（产后0～14天）的奶牛进行牛乳采集。

1.4 样品前处理与测定

1.4.1 样品处理

处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作，提取过程应在通风柜中操作。

（1）皂化

称取50.00g（精确至0.01g）液体试样于150mL平底烧瓶中，固体试样需加入约20mL温水，混匀，再加入1.00g抗坏血酸和0.10gBHT，混匀，加入40mL无水乙醇，加入10mL氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于60℃恒温水浴震荡皂化45.000min，皂化后立即用冷水冷却至室温。

（2）提取

将皂化液用30mL水转入250mL的分液漏斗中，加入50mL石油醚，振荡萃取5.000min，将下层溶液转移至另一250mL的分液漏斗中，加入50mL的石油醚再次萃取，合并醚层。

（3）洗涤

用约100mL水洗涤醚层，约需重复3次，直至将醚层洗至中性（可用pH试纸检测下层溶液pH值），去除下层水相。

（4）浓缩

将洗涤后的醚层经无水硫酸钠（约3.00g）滤入250mL旋转蒸发瓶中，用约15mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发仪上，于40℃水浴中减压蒸馏浓缩，待瓶中醚液剩下约2mL时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹至近干。用甲醇分次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度。溶液过0.22μm有机系滤膜后供高效液相色谱测定维生素A。

1.4.2 分离条件（反相液相色谱条件）

色谱柱：C18柱（柱长250.0mm，内径4.6mm，粒径5μm）；柱温：25℃；流动相：甲醇；流速：1mL/min；紫外检测波长：维生素A为325nm；进样量：10μL。

2 结果分析

2.1 维生素A目标峰的确定

通过采用上述方法对样品和标准品进行处理，图谱见图1、2。可以看出维生素A标准品和样品出峰时间均为3.297min。通过对不同时期样品的谱图进行分析，发现维生素A在该保留时间与其他峰都得到较好的分离，该保留时间内没有检测到干扰峰，并验证了此方法的有效性。因此，可以确定母乳中维生素A目标峰的保留时间为3.297min。

图1 维生素A标准品图谱

图2 含维生素A母乳图谱

2.2 标准曲线、检出限及母乳定量重复性

根据实验检测浓度的要求，测量范围应覆盖方法的最低浓度水平（定量限）和关注浓度水平，确定维生素A标准曲线浓度范围为0.0958μg/mL，0.1915μg/mL，0.3831μg/mL，0.7661μg/mL，1.5323μg/mL，1.9153μg/mL（浓度均经过分光光度计校正）测定标准曲线（规定曲线包含0点但不强制过0点），每一点浓度测定3次，使用3次数据拟合得到以下线性参数，各浓度点对应的浓度和峰面积见表1。

表1 维生素A标准溶液浓度与对应峰面积

最终得出维生素A的拟合标准曲线的线性方程为Y=1.4090X-0.00247，此时R2=0.9995（图3）。标准曲线线性回归方程相关系数大于0.9900，浓度范围覆盖关注浓度的0%～150%，符合《GB/T27417—2017合格评定化学分析方法确认和验证指南》的要求。

图3 维生素A标准溶曲线

采用标准偏差法，选择阴性样品（即试样中本身不含有维生素A）试样，称取10份，每份称取5.00g左右，按标准方法进行检测按检出限的表示方法为3倍标准偏差（结果见表2），定量限为LOD的3倍。称完阴性样品后每个样品中加入390μL，浓度为1.9153μg/mL的维生素A标准工作液。按照标准方法进行后续处理，并计算出标准偏差，以及LOD和LOQ。

从表2及图4的结果可见，液体乳试样称样量为5.00g，定容体积为10 mL时，维生素A方法检出限为3.98μg/100g，方法定量限为11.90μg/100g。低于该方法规定的检出限和定量限（称样量为5.00g，定容体积为10 mL时，维生素A的紫外检出限为10.00μg/100g，定量限为30.00μg/100g）。

表2 维生素A方法检出限与定量限结果

图4 10次加标试验数据叠加

2.3 各阶段的母乳和牛乳中维生素A含量

母乳和牛乳中不同时期实验分组测定维生素A含量见表3。

通过表3数据对比，母乳初乳期中维生素A含量略高于牛乳中维生素A的含量，但母乳维生素A的含量会随着哺乳时间的增长和饮食习惯的变化显著减小。

表3 牛乳和母乳不同时期分组维生素A含量

3 讨论

液相色谱法测定维生素A含量检出灵敏度一般，因此，本文在设计实验时，对《GB 5009.82—2016食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定》方法中维生素A的检出限和定量限进行了论证，通过采用更新型仪器设备，增加样本量来提高灵敏度的方法。对于成分复杂的母乳通用性更强，测定数据更准确。反向高效液相紫外检测器测定牛乳和母乳中维生素A，前处理简便，仪器基线稳定，重现性好，检测灵敏度高，可以满足分析要求，为以后母乳和牛乳中维生素A测定方法提供参考。

本文在进行实验设计时，较其他同类文章针对母乳在初乳期，过渡期和成熟期3个时期维生素A含量进行采样分析，发现母乳中的维生素A会随着哺乳期的深入而逐渐减小，为以后研发婴幼儿配方奶粉、细化婴幼儿喂养需求提供了更为细致的数据支撑[7]。相对于母乳来说，在哺乳后期应该更佳注重富含维生素A营养物质的食物的摄入，例如芒果、木瓜以及多种绿叶蔬菜，来提高自身母乳中维生素A的含量。对于缺乏维生素A的婴幼儿，应食用添加维生素A营养强化剂的婴幼儿配方奶粉[8]。通过对母乳和牛乳维生素A含量测定进行了分析比较，牛乳作为最广泛的奶制品，为牛乳液态配方奶中维生素A含量添加提供了一定的理论基础。