中性粒细胞蛋白-1、-2、-3在膀胱癌患者组织中的表达及与预后的相关性

雪合热提·萨塔尔 凯赛尔·阿吉 李前进 木拉提·热夏提△

（新疆医科大学，1 第六附属医院泌尿外科，2 第一附属医院泌尿外科，乌鲁木齐 830054）

膀胱癌是泌尿生殖系统最为常见的恶性肿瘤，经尿道膀胱肿瘤电切术和辅助放化疗是治疗膀胱癌的首选治疗方式[1]，但是膀胱癌术后复发及多发性转移的情况仍然较多，因此寻找与发生及术后复发相关的指标十分重要。中性粒细胞蛋白（neutrophil protein，HNP）的表达与不同类型的肿瘤和细胞系有关[2]。在肺癌和口腔癌患者的下颌下腺中检测到HNP-1[3]。HNP1-3 已被证明在肾癌细胞系中表达，并且在人类白血病细胞中，特定HNP 前体肽的表达被上调[3-4]。研究表明，HNP1-3 在肿瘤中的表达主要来源于侵袭嗜酸性粒细胞和中性粒细胞[5]。然而，有研究表明，在膀胱癌患者尿液中观察到过量HNP1-3 实际上是膀胱癌细胞产生的，而高侵袭性膀胱癌细胞产生的HNP1-3 要比低侵袭性的多[6]。目前尚不清楚HNP1-3的上皮性表达是由炎症状态诱导的，还是由邻近的中性粒细胞释放，并被上皮细胞吸收引起的，因此，HNP1-3在肿瘤中的上调表达可能主要源于入侵的免疫细胞，但也可能是由产生HNP1-3的癌细胞启动的。关于三者在膀胱癌组织中的表达、临床特征及与预后的之间研究较少，因此本研究采用免疫组织化学法检测HNP-1、HNP-2和HNP-3蛋白在膀胱癌组织中的表达情况，并结合临床病理学特征及预后相关因素进行分析，研究这3个蛋白在膀胱癌中的表达及其对预后的意义。

1 材料和方法

1.1 一般资料

研究对象为2015年1月至 2019年12月期间就诊于新疆医科大学第一附属医院泌尿外科的患者，住院经手术切除的膀胱尿路上皮细胞癌组织标本139 例及癌旁正常组织62 例，其中男102 例，女37例，年龄42 ～78 （57.2±3.4） 岁；所有标本都经过病理科确诊。以上纳入研究的患者均无术前放疗、化疗史，本研究经医院伦理委员会批准，所有患者及其家属签署了知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

兔多克隆抗体HNP-1、兔单克隆抗体HNP-2、兔多克隆抗体HNP-3（美国Abcam 公司）；徕卡DM3000 数码显微镜（德国徕卡微系统有限公司）。

1.3 免疫组织化学显色

切片脱蜡，抗原修复，加HNP-1、HNP-2 和HNP-3抗体（HNP-1 为1∶100，HNP -2 为1∶150；HNP-3 为1∶100），加适量生物素标记二抗工作液，显色剂显色，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。显微镜下观察染色结果。用数字切片扫描仪对切片进行拍照，观察染色结果，细胞质内所见棕黄色或棕褐色颗粒即为HNP-1、HNP-2 和HNP-3染色阳性，采用Image Pro Plus 6.0 进行分析，每个样本随机选取6 个视野，测量每个视野阳性染色面积（μm2），计算阳性染色面积与总面积比值。

1.4 统计学处理

数据处理采用SPSS 22.0 统计软件进行统计分析，数据以±s表示，组间比较用t检验，计数资料采用χ2检验，采用Spearman 等级相关分析对检测指标进行相关性分析，生存分析用GraphPad Prise 软件的log-rank（Mank-Cox）检验方法，以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌和癌旁正常组织中HNP-1、HNP-2 和HNP-3 蛋白的表达

在膀胱癌和癌旁正常组织中，HNP-1 蛋白表达阳性率分别为 70.50%、8.1%，HNP-2 蛋白表达阳性率分别为72.66%、3.23%，HNP-3 蛋白表达阳性率分别为71.94%、6.45%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1，表1）。

表1 膀胱癌和癌旁正常组织中HNP-1、HNP-2 和HNP-3 蛋白表达

图1 癌旁组织（A）和膀胱癌（B）HNP-1（A1，B1）、HNP-2（A2，B2）和HNP-3（A3，B3）免疫组织化显色，SP，标尺=50 μm，×200

2.2 膀胱癌组织HNP-1、HNP-2 和HNP-3 表达与临床病理特征的关系

对139例膀胱癌组织中HNP-1、HNP-2 和HNP-3 表达与临床病理特征之间的关系进行分析，HNP-1、HNP-2 和HNP-3 在膀胱癌患者中的表达水平与肿瘤的病理分级、临床分期、淋巴结转移及复发等生物学行为相关（表2）。

表2 膀胱癌组织标本中HNP-1、HNP-2 和HNP-3 表达与临床病理特征的关系

2.3 Spearman 相关分析

经 Spearman 相关分析，在膀胱癌组织中HNP-1、HNP-2 和HNP-3 表达呈正相关（r=0.679，P＜0.01；r=0.746，P＜0.01） 。

表3 HNP -1、HNP -2 和HNP-3 在膀胱癌中表达的相关性

2.4 HNP-1、HNP-2 和HNP-3 表达与膀胱癌患者的生存分析

所选研究对象5年总生存率为71.26%。HNP-1表达阳性、表达阴性的患者5年生存率为62.43%、87.61%；HNP -2 表达阳性、表达阴性患者5年生存率为64.15%、83.19%；HNP -3 表达阳性、表达阴性患者5年生存率为61.39%、94.27%，三者差异均有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图2 HNP-1、HNP-2 和HNP-3 蛋白的表达程度与膀胱癌患者生存率之间的关系

2.5 Cox比例风险回归模型分析影响膀胱癌预后的因素

Cox比例风险模型分析临床病理因素、HNP-1、HNP-2 和HNP-3 的表达对膀胱癌预后的影响。单因素回归分析显示：临床分期、淋巴结转移、肿瘤大小及HNP-1、HNP-2 和HNP-3 的表达是影响膀胱癌预后的因素（P＜0.05）；将以上因素纳入多因素回归分析，结果显示临床分期、淋巴结转移及HNP-1、HNP-2 和HNP-3 的表达是影响膀胱癌预后的关键风险因素（P＜0.05）（表4）。

表4 Cox 比例风险回归模型分析膀胱癌预后的因素

3 讨论

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，在所有癌症死亡中占5%，仅在美国的医疗费用就占到了40亿美元。男性患此病的概率是女性的4 倍。据估计，2021年将有79 690 例诊断为膀胱癌，约15 580 例死亡。这种肿瘤最常见的形式是尿路上皮细胞癌，占膀胱癌的90%。膀胱癌的最初症状包括血尿、尿频、排尿时的不适和疼痛[7]。目前已有许多风险因素，其中最主要的因素是吸烟，吸烟会使膀胱癌的发病率比不吸烟的人增加4 倍[8]。近一半的膀胱癌可归因于吸烟，因为吸烟会引起慢性炎症。膀胱癌的诊断通常需要尿细胞学检查或膀胱镜检查。由于复发率高达近80%，治疗困难，因此，必须进行长期随访。

本研究中对膀胱癌组织与癌旁组织中HNP-1、HNP-2 和HNP-3 蛋白的表达进行比较，结果显示，与癌旁组织相比，在膀胱癌组织中，HNP-1、HNP-2和HNP-3 等促炎症因子表达程度较高，HNP-1、HNP-2 和HNP-3 在膀胱癌组织中表达水平明显高于癌旁组织，进一步分析HNP-1、HNP-2 和HNP-3蛋白阳性表达率与膀胱癌临床特征之间的关系，提示HNP-1、HNP-2 和HNP-3 表达与患者年龄、性别和肿瘤大小均无相关性，但是在病理分级和临床分期越低、淋巴结发生转移及复发的组织中HNP-1、HNP-2 和HNP-3 表达升高，差异具有统计学意义；结果显示HNP-1、HNP-2 和HNP-3 表达与临床病理特征呈明显相关，且HNP-1、HNP-2 和HNP-3表达呈正相关，由此推测HNP-1、HNP-2 和HNP-3膀胱癌的发生和发展过程中可能有一定程度的协同作用，证实三者与膀胱癌的发生、发展、转移及复发密切相关。

Spearman 分析这3 个蛋白之间的相关性，提示膀胱癌中HNP-3 的表达分别与HNP-1、HNP-2 的表达呈正相关，推测与HNP-3 的生物学功能有关，HNP-3 与HLA-II 类分子结合，能够在刺激后降低HLA-DR 限制性T 细胞系的增殖，并且可以通过这种方式帮助癌细胞避免局部免疫识别，随后通过与趋化因子受体CCR6 的相互作用，招募树突状细胞和T 细胞，上调的免疫反应可刺激肿瘤增殖，免疫细胞被肿瘤积极招募，从而发挥其促血管生成和促进转移的作用[9]。生存曲线结果显示，膀胱癌患者5年总生存率为71.26%。HNP-1、HNP-2 和HNP-3表达阳性的患者5年生存率分别显著低于表达阴性的患者，Cox 比例风险模型分析结果显示临床分期、淋巴结转移及HNP-1、HNP-2 和HNP-3 的表达是影响膀胱癌预后的关键风险因素。进一步证实HNP-1、HNP-2 和HNP-3 蛋白的表达不仅参与肿瘤的发生发展，还影响患者预后情况。

研究显示中性粒细胞对癌细胞有靶向作用，这些细胞起着重要的抗癌作用。但是，如果过度表达，它们也会刺激过度产生炎症，向肿瘤细胞释放生长因子，分泌基质降解酶，进一步导致肿瘤向癌症发生、发展[10-11]。

Gunes 等[12]报道膀胱癌患者的3 种中性粒细胞蛋 白HNP-1、HNP-2 和HNP-3水平增加。这3 种HNP 都是α-防御素的亚型，这种蛋白有助于白细胞的募集，并可能导致转移。HNP1-3 在膀胱癌中的直接作用机制尚待阐明[13]。HNP1-3 的间接作用包括刺激肿瘤细胞增殖和潜在的肿瘤血管生成。这可能是由于HNP 促进细胞因子释放，刺激单核细胞，抑制纤溶系统的结果[14]。在癌细胞中发现的HNP 主要来自肿瘤侵袭的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞[15]。研究表明，HNP1-3 在膀胱癌患者的血浆中含量升高，这可能是由于中性粒细胞损伤所致。此外，Mumcu 等[16]报道膀胱癌患者尿液中HNP 1-3水平升高，较高水平的HNP 对单核细胞具有细胞毒性，进一步升高将导致细胞损伤，显著升高的HNP 水平对所有细胞系都具有细胞毒性。

综上所述，HNP-1、HNP-2 和HNP-3 在膀胱癌组织中均呈高表达，且表达程度随肿瘤的发展而上升； HNP-3 与HNP-1 和HNP-2 的表达均呈正相关；3 种蛋白阳性表达的患者生存率显著降低，HNP-1、HNP-2 和HNP-3 均是影响膀胱癌预后的关键风险因素。因此，中性粒细胞在人类中性粒细胞蛋白的产生和分泌中具有潜在的作用，可能促进肿瘤在膀胱的侵袭和发展。