促红细胞生成素对急性肾损伤大鼠肾小管细胞凋亡和p-MAPKAPK-2表达的影响*

李素文 刘晓清 向 慧

（长沙市第三医院肾内科，长沙 410000）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是由 多种疾病导致的肾功能下降的临床常见病，如不及时治疗，容易发展为慢性肾病，甚至导致终末期肾病出现[1]。缺血再灌注是急性肾损伤最常见病因[2]。肾处于缺氧缺血条件时，肾细胞处于敏感时期，肾小管会分泌大量炎症因子，导致多种凋亡信号通路出现，诱发肾小管上皮细胞出现大数量凋亡[3-4]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是各种肥大刺激因子中胞内信号转导的通用路径，而MAPKAPK-2 属于此信号通路相关直接底物，其活性增强，并激活下游一系列因子，影响细胞周期、凋亡，调控血管新生[5-6]。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是一种能对中枢神经系统的发育起调节作用的多功能营养因子，亦发挥神经营养效用，同时作为神经保护因子存在[7]。以往研究表明EPO 可抑制肾小管上皮细胞凋亡，但EPO 对肾小管细胞凋亡的作用机制及对MAPKAPK-2 表达的影响尚不明确。本研究旨在探讨EPO 对急性肾损伤大鼠肾小管细胞凋亡和MAPKAPK-2 水平的影响。

1 材料和方法

1.1 动物和主要试剂

30 只SD 雄性大鼠（长沙天勤生物公司），体质量（225.00±11.07）g，16～17周龄。TRIzol 试剂（浙江AMEKO 公司），逆转录试剂盒（武汉赛维尔公司），RT-PCR 试剂盒（上海优予公司）。

1.2 分组

30 只大鼠随机分为假手术组、模型组和EPO治疗组，每组10 只。3 组大鼠均经10%苯巴比妥钠麻醉后开腹，模型组、EPO 治疗组大鼠常规脱毛、消毒后，分离右肾蒂及输尿管，采用1 号丝线结扎肾蒂和右输尿管，继续分离左肾，采用无创伤性夹钳闭合肾动脉35 min，后采用生理盐水腹腔灌注，逐层关闭腹腔，建立急性肾损伤大鼠模型。假手术组打开腹腔，并进行左右两肾分离肾被膜，逐层关闭腹腔。EPO 治疗组腹腔注射EPO 50 U/kg，每周3 次，共计6 周。

1.3 肾功能指标检测

6 周后采集大鼠下腔静脉血 5 mL，3 000 r/min离心10 min，分离血清，ELISA 法测定血清大鼠血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素（urea），肾损伤分子（kidney injury molecule 1，KIM-1）水平。所有步骤严格按照说明书操作。

1.4 H-E 染色观察肾组织病理变化

假手术组、模型组、EPO 治疗组大鼠实验结束后，腹腔注射麻醉断头处死大鼠，分离肾组织标本，甲醛固定60 min，常规石蜡包理制片，片厚4 μm，采用苏木精和伊红染色液复染分别为6 ～ 8 min 和10 s，选取染色清晰切片，放在高倍镜下（×400）观察肾组织病理学改变，并拍照。结果由病理科医师采用单盲法观察肾组织的病理损伤变化（肾小球体积、毛细血管基底膜厚度和肾小管上皮细胞空泡等）。病理评估标准参考文献[6]。

1.5 RT-PCR 法检测肾组织MAPKAPK-2 水平变化

将胰蛋白酶加入大鼠肾组织中进行消化反应，进行PBS冲洗，然后滴入0.9%NaCl溶液，总RNA采用TRIzol法来提取，总RNA提取反转录成 cDNA，用DNA荧光染料SYBR GreenⅠ对p-MAPKAPK-2表达水平进行检测，p-MAPKAPK-2上游引物序列：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物序列：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'；内参采用β-actin。PCR反应条件：60 ℃，10 min、95 ℃、72℃，各 30 s、95℃，5 min，40个循环，实验次数至少3次，用相对定量2-ΔΔCT计算p-MAPKAPK-2表达。

1.6 免疫印迹检测肾组织p-MAPKAPK-2 蛋白表达

肾组织加入蛋白裂解液，离心，后将取得溶液加入样孔。电泳后，取下PVDF 膜TBS 浸泡10 min，密封，PBS 反复冲洗，然后加一抗（1：500），40℃杂交1 d，重复上述清洗步骤，加入二抗（1：2 000），杂交2 h。将膜浸入ECL 工作液，随后进行检测，获取电泳图像。

1.7 流式细胞术检测肾小管细胞凋亡情况

取大鼠肾组织，并剪碎，PBS 清洗后收集清洗液80 目筛网过滤，再用PBS 洗涤离心重悬，纯化肾小管节段，并接种于培养皿中，收集从肾小管节段中爬出的细胞，对其进行洗涤2 次，离心5 min，选择100 μL 的1×结合缓冲液，进行重悬细胞操作，用5 μL 标记FITC 的Annexin Ⅴ与5 μL PI 染色混匀，避光孵育15 min 后加入与400 μL 结合缓冲液混匀，洗涤3 次对肾小管细胞情况进行检测。

1.8 统计学处理

应用 SPSS 19.0 统计软件进行分析。计量数据用±s表示，组间比较采用χ2或t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾功能指标

与假手术组比较，模型组大鼠肾功能出现明显下降，血Scr、尿素、KIM-1 值增加。与模型组比较，EPO 治疗组大鼠血Scr、Urea、KIM-1 值下降，肾功能有所好转（P＜0.05）（表1）。

表1 各组大鼠肾功能指标比较（n=10，±s）

表1 各组大鼠肾功能指标比较（n=10，±s）

*P＜0.05 vs 假手术组；#P＜0.05 vs 模型组

组别 Scr（μmol/L） 尿素（mmol/L） KIM-1（μg/L）假手术组 47.85±4.98 8.12±2.78 1.13±0.13模型组 106.51±14.51* 20.64±5.25* 2.45±0.32*EPO 治疗组 70.11±7.35*# 13.27±3.51*# 1.72±0.20*#

2.2 各组大鼠肾组织病理变化比较

假手术组肾结构完整清晰，肾组织未见水肿、炎症细胞浸润。模型组肾组织明显水肿，炎症细胞浸润，肾间质见散在出血点及多量炎症细胞浸润。EPO 治疗组肾组织损伤情况有所改善，肾小管周围组织炎症浸润较模型组减轻（图1）。

图1 各组大鼠肾组织结构变化比较，H-E 染色，×200

2.3 各组大鼠肾组织p-MAPKAPK-2 mRNA 表达

假手术组、模型组和EPO治疗组肾组织p-MAPKAPK-2 mRNA表达量分别为0.32±0.05、0.78±0.07及0.55±0.06，模型组大鼠较假手术组p-MAPKAPK-2 mRNA表达升高，EPO治疗组较模型组p-MAPKAPK-2 mRNA表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠肾组织中p-MAPKAPK-2 蛋白表达

假手术组、模型组和EPO治疗组肾组织p-MAPKAPK-2蛋白表达分别为0.42±0.07、0.81±0.10及0.53±0.04，模型组大鼠较假手术组p-MAPKAPK-2蛋白表达显著升高，EPO治疗组较模型组p-MAPKAPK-2蛋白表达下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图2 各组大鼠肾组织p-MAPKAPK-2 蛋白表达

2.5 各组大鼠肾小管细胞凋亡比较

假手术组、模型组和EPO 治疗组大鼠肾小管细胞凋亡率分别为5.68%±0.23%、19.62%±1.20%及13.02%±0.80%，模型组大鼠较假手术组肾小管细胞凋亡率增加，EPO 治疗组较模型组肾小管细胞凋亡率下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图3）。其中，模型组大鼠肾小管细胞凋亡率最高，EPO 治疗组其次，假手术组最低。

图3 各组大鼠肾小管细胞凋亡情况比较

3 讨论

急性肾损伤治疗和预防是临床工作者关注的重点，由于患者致病因素较多，主要原因包含感染、肾毒性药物及缺血再灌注等，其中缺血再灌注是诱发该疾病产生最常见的病因[8]。有研究表明急性肾损伤病因与肾血流量急剧减少有关，肾小管细胞性质改变及凋亡，严重时会促进多种蛋白因子产生，堵塞肾小管[9-10]。而EPO对于急性肾损伤引起的肾小管细胞凋亡有抑制作用，临床应用较广范[11]。而MAPK信号对急性肾损伤发生、发展有重要作用，研究者深入研究，证实PI3K/AKT信号可促进炎症因子的分泌，使肾小管细胞凋亡，导致病情向不可控方向发展[12-13]。而p-MAPKAPK-2属于MAPK作用底物之一，其水平升高可使肾小管细胞凋亡，导致病情向无法挽救方向发展[14]。

肾组织生长发育过程中，EPO 可对肾组织发挥保护作用，其作用在于EPO 会增强肾组织受损区域新生血管的能力，改善肾功能，加快损伤区域细胞、组织功能恢复[15]。急性肾损伤大鼠组织中p-MAPKAPK-2 活性升高，肾组织细胞功能受p-MAPKAPK-2 活性的影响，肾功能受到严重损伤，通过干预手段抑制其活性后，病情能得到明显改善[16]。有研究者证实，EPO 在多个细胞自我维持和增殖、分化的调控中发挥着重要作用，EPO与其配体结合后可避免组织细胞的凋亡，在进入机体组织后激活相关信号通路，促进细胞功能恢复，且对肾功能也有明显改善作用[17-18]。本研究结果显示，模型组大鼠肾功能出现明显下降，EPO治疗组大鼠肾功能有所好转，说明采用EPO 干预后急性肾损伤大鼠肾功能改善，肾组织炎症浸润降低，和上述研究结果相符。有文献报道，急性肾损伤患者p-MAPKAPK-2 表达呈升高趋势，如保持p-MAPKAPK-2 表达处于抑制状态，患者疾病进展也会得到明显抑制[19-20]。有研究证实，在肾缺血再灌注大鼠肾组织中p-MAPKAPK-2 水平呈升高趋势，会使肾损伤状态加重[21]，而另一项研究表明EPO 对急性肾损伤大鼠的改善作用是通过激活MAPK 来实现，MAPKAPK-2 是MAPK 通路的重要作用底物，可对多个细胞凋亡起调控作用[22]。本研究结果显示，模型组大鼠p-MAPKAPK-2 水平升高明显，EPO 治疗组大鼠p-MAPKAPK-2 水平有所下降，肾上皮细胞凋亡改善。说明采用EPO 干预后急性肾损伤大鼠改善肾组织上皮细胞凋亡，其机制与抑制MAPKAPK-2 信号通路相关。