利用基因工程获取红色荧光大肠杆菌*

孙 娟 王思睿

（北京市第五十七中学 北京 100038）

高中生物学教材涉及大量实验，例如，在生物学选修1 中有微生物的实验室培养、微生物的分离与计数[1]等，在选修3 中有基因工程实验等内容。教材中大部分实验操作都是孤立存在的，更多的是展示一个特定实验的开展和完成过程，但在解决实际问题时，学生往往缺乏将所学习的实验内容融会贯通地组合应用，并设计一个完整实验的相关训练。

通过学习，学生可掌握实验技巧，却难以深刻理解每个实验在科研工作中的实际应用。因此，本实验的设计旨在使学生在一个较为完整的实验过程中融会贯通地应用所学知识。本实验将选修1、选修3 中的相关实验进行融合，通过将红色荧光基因（Cherry）转入大肠杆菌的科学实践活动，促进学生领悟在实验中系统地应用教材知识，从而进一步拓展学生的视野、提高学生的学习兴趣和动手能力，在活动中提升学生的生物学学科核心素养。

1 实验原理

质粒是一种结构简单，存在于细菌拟核DNA之外，具有自我复制能力的小型环状DNA 分子[2]。利用质粒作为基因工程的载体，能有效将外源基因转入细胞。可通过PCR 等技术获得目的基因，利用限制酶和DNA 连接酶可将目的基因连入质粒中，构建重组质粒。

经Ca2+处理后的大肠杆菌感受态细胞能吸收周围环境中的DNA 分子，利用热激法可将重组质粒导入感受态细胞。目的基因随着重组质粒进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化[3]。

本实验采用的质粒含有氨苄青霉素抗性基因，转化成功的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的LB 培养基中存活，并且目的基因可表达出红色荧光蛋白，以上2 点均为筛选转化成功大肠杆菌的依据。

2 实验仪器和材料

仪器与耗材：恒温水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、移液器、电子秤、锥形瓶、酒精灯、药匙、1.5 mL EP 管等。

材料与试剂：含有红色荧光基因的重组质粒、大肠杆菌JM109 感受态细胞（此感受态转化效率高，且常用于目的基因的表达）、琼脂、NaCl、酵母粉、蛋白胨、氨苄青霉素等。

3 实验过程

3.1 制备培养基

1）称量：称取蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g。

2）熔化：将称量好的蛋白胨、酵母膏和NaCl 加入烧杯中，用玻璃棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其熔化。当琼脂完全熔化后，补加蒸馏水至1 000 mL。液体培养基不加入琼脂（同时制备不含琼脂的液体培养基用于细菌的培养的保存）。

3）灭菌：将配制好的培养基转移至锥形瓶中，封口，并用皮筋勒紧，再置于高压蒸汽灭菌锅内，121℃，灭菌20～30 min。

4）倒平板：待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。其中，一部分培养基添加氨苄青霉素，使其终浓度为100 μg/mL，制备抗性平板培养基。

3.2 大肠杆菌的转化

1）将100 μL 感受态细胞置于冰上融化。

2）向感受态细胞悬液中加入10 μL 带有红色荧光基因的重组质粒，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰上放置30 min。

3）将离心管置于42℃水浴锅中放置90 s，然后快速转移至冰中放置2～3 min，注意不要摇动离心管。

4）向离心管中加入500 μL 无菌、无抗性的LB培养基，37℃、180 r/min 振荡培养1 h。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

3.3 涂布平板

1）取适量已转化的感受态细胞菌液，滴加至含氨苄青霉素的LB 培养基表面。涂布用量可根据具体实验进行调整，例如，转化的DNA 总量较多，可取100 μL 左右转化产物涂板；反之，如果转化的DNA 总量较少，可取200～300 μL 的转化产物涂板。

2）将涂布器在火焰上灼烧，冷却。

3）用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，使菌液分布均匀。

4）涂布剩余的菌液4℃保存。如果次日的转化菌落数过少，可将剩余的菌液再涂布新的平板。

3.4 过夜培养 将涂布完的平板倒置于恒温培养箱内，在37℃的条件下培养24 h。

3.5 筛选与纯化

1）培养12 h 后，观察菌落的形态和颜色；如果没有红色菌落，则继续培养24～36 h，挑选出培养基上红色的菌落。

图1 转化成功后的红色菌落（方框内所示）

2）用灭菌的牙签挑取红色菌落，在LB 培养基上通过平板划线法纯化红色大肠杆菌，以上操作皆在酒精灯火焰旁完成，接种环在接触菌液和每次划线前都要在酒精灯上灼烧。

3）第1 次划线完成后培养24 h，挑选出红色基因表现最明显的菌落再进行培养。划线操作可重复多次以达到纯化目的。

图2 平板划线法纯化获得的红色大肠杆菌菌落

4）将最后得到的纯化过的红色大肠杆菌冷冻保存在含有30%甘油的LB 液体培养基中。

3.6 课时安排建议 本实践活动可分3 课时完成。第1 课时，学生可学习培养基的配制、灭菌技术、倒平板等操作；第2 课时，学生可完成细菌的转化实验、稀释涂布等操作；第3 课时，学生可完成转化细菌的筛选和鉴定，并作进一步的分离纯化（平板划线法）。有条件的情况下，还可进一步扩大培养红色荧光细菌，并提取其中含有红色荧光基因的重组质粒。

每节实践活动都以“理论+实践”的模式进行，以理论指导实践，以实践验证理论，在探索活动中促进学生全面学习。

4 结果与讨论

本实验将教材中零散的实验知识整合，使学生对所学实验知识在实际科研中的应用有了更加具体、清晰地认识，体验较系统、完整的实验操作流程。在支架式教学理念中，每个实验的学习都是按“最近发展区”的要求建立基础概念的过程，通过创建“获取红色荧光细菌”的情境，学生可在独立探索和协作学习中，更好地体会、领悟各小实验在大实验流程中的价值，在实验开展和结束后不断进行效果评价，并针对出现的问题加以解决，从而促进知识的学习和能力的提升。

通过实践发现，大肠杆菌转化实验对于中学生难度并不大，学生能在不占用太多课余时间的情况下完成实验。学生亲身体验实验过程有助于提升学生学习生物学的兴趣、培养学生的生物学学科核心素养。学生自己设计实验方案、动手操作也培养了学生的动手能力和解决问题的能力[4]。本实验由于条件受限，直接采购了含有Cherry基因的质粒，希望在将来能将DNA 的提取、质粒的提取、PCR 和琼脂糖凝胶电泳等实验过程都加入其中，使学生能感受更加完整、系统的实验。