小鼠透明骨骼塑化包埋标本的制作研究*

李雁羽 刘天润 吴 启 王 磊

（安徽农业大学生命科学学院 安徽合肥 230036）

透明骨骼标本是通过透明剂、染色剂、脱色剂的处理，让动物肌肉组织透明化，骨骼由染色剂凸显出形状的标本[1-3]。染色剂中的茜素红可特异性与硬骨中的钙结合，让其呈现红色，而阿利新蓝在合适的pH 值下可让软骨中硫酸软骨素、硫酸角质素等主要成分呈现蓝色。二者配合使用，可让观察者透过肌肉组织直观地观察动物体内硬骨和软骨的结构和分布[4]。

为了让包埋剂起到更好的包埋效果，需对透明骨骼标本进行塑化处理，而聚乙二醇可用于简易塑化标本的制作[5-6]。PEG-600，即分子量为600的聚乙二醇，常温下为液态，是水溶性聚合物，利用梯度浸渍的方法可让PEG-600 对生物标本起到较好的塑化作用。传统的包埋标本使用的AB胶（室温固化环氧树脂）固化时间较长，UV 胶（又称“紫外光固化胶”）是一种必须通过紫外光照射才能固化的胶粘剂，固化速度快，透光性强，它作为包埋剂已应用于植物标本制作领域[7]。

本研究工作主要通过塑化技术处理透明骨骼标本，再利用UV 胶的紫外固化特性实现快速包埋，改良了透明骨骼标本的保存方法，使其便于运输，促进其实现商业化生产及推广应用[8-9]。

1 材料与方法

1.1 实验材料 出生2～4 d 的小鼠、无水乙醇、丙酮、茜素红、阿利新蓝、氢氧化钾、甘油、PEG-600、UV 胶、长方体硅胶模具（大小：50 mm×85 mm×50 mm）。

1.2 实验方法

1）初步处理方法。处死小鼠，剥离皮肤，在接近肢端时不要剥离皮肤，避免损伤小鼠趾端和尾部的结构，去除其内脏，并用清水冲洗干净。

2）试剂配制方法。A 液：茜素红原液。在质量分数95%的乙醇溶液中加入茜素红直至饱和。

B 液：茜素红应用液。将A 液与体积分数70%的乙醇溶液以体积比1∶9 的比例混合均匀，再加入等体积的质量分数1%的KOH 溶液，即配制成茜素红应用液。

C 液：阿利新蓝软骨染液。10 mg 阿利新蓝、80 mL 体积浓度95%的乙醇溶液、20 mL 冰醋酸，混合均匀，静置一夜后次日使用。

D 液：预透明液。质量分数2%的KOH 溶液。

E 液：透明液Ⅰ。氢氧化钾1 g、甘油20 g，加蒸馏水至1 000 mL。

F 液：透明液Ⅱ。甘油与蒸馏水1∶1 混合。

1.3 透明骨骼标本制作

1）脱水固定。将初步处理的材料依次放入80%、90%、100%3 个浓度梯度的乙醇中浸泡，每个浓度浸泡24 h。可根据标本大小及实际的脱水情况，增减每个浓度浸泡的时间。

2）脱脂。将脱水固定之后的标本放入丙酮中进行脱脂，时间为1～3 d，脱脂完成后将标本使用清水浸泡，直至标本沉底。

3）软组织染色。将脱脂完成的材料在C 液中浸泡1～2 d。具体浸泡的时间，可根据标本的染色情况灵活地进行调整。可检查腕关节、踝关节等处是否上色，以此确定是否继续染色。

4）复水。将标本从C 液中取出，置于无水乙醇中1～3 d。而后将标本从无水乙醇中取出，依次浸泡于95%、75%、45%、15%的梯度浓度乙醇溶液中，在每个梯度浸泡至标本在容器中沉底为止，最后浸泡于蒸馏水中。

5）预透明。将复水之后的材料置于D 液中进行预透明。预透明的作用是脱色和提升后续试剂的穿透能力，预透明的时长把握很重要，一般在隐约可见骨骼，肌肉呈果冻状时停止预透明。

6）硬骨染色。将标本置于B 液中浸泡，直至硬骨被染成紫红色为止。浸泡时间一般为1 d，需根据标本是否剥皮，预透明程度等实际情况灵活调整染色时间。

7）分色及再度透明。将标本在E 液中浸泡1～2 d，而后入F 液中浸泡，直至标本肌肉组织脱色，可观察到被染色的骨骼结构为止。

8）甘油梯度透明。将标本依次浸入体积分数为40%、50%、60%、80%的甘油各2 d，然后浸入纯甘油浸泡，直至肌肉无色透明，骨骼结构清晰可见为止。

9）塑化。选择PEG-600 作为塑化剂。向质量分数0.5%的氢氧化钾溶液加入几粒麝香草酚晶体，充分混合。再加入适量PEG-600，分别配制成体积浓度为15%、25%、50%、75%、100%的PEG-600 溶液，将标本依次放入其中浸泡。15%浓度时浸泡1～2 d，后续每个梯度的浸泡时间为2～3 d，这样即可使PEG-600完全替换其中的甘油，完成塑化。

10）包埋。向硅胶模具中倾倒UV 胶，待其没过模具底部1 cm 左右时停止倾倒，将模具置于紫外线照射环境中。待底层的UV 胶固化之后，将塑化好的标本放入模具，调整姿势，再灌注UV胶，直至没过标本1 cm 左右。将模具置于紫外线照射环境下，待UV 胶完全固化之后，将包埋好的标本脱模取出即可。

图1 小鼠不同制作时期的透明骨骼塑化包埋标本

2 结果

2.1 标本整体效果 所制的小鼠标本显著地展示了硬骨和软骨的分布情况（图2），肋软骨、关节软骨、鼻软骨等软骨被染成蓝色，肱骨、脊椎、肩胛骨等硬骨被染成红色，尚未完全硬骨化的尾椎为淡红色（图3、图4）。标本被UV 胶包埋，坚固透明，便于运输和观察骨骼结构，具有很好的观赏价值和科学教育价值。

图2 小鼠透明骨骼塑化包埋标本正面图

图3 标本躯干前部细节图

图4 标本躯干后部细节图

2.2 UV 胶固化效果 传统包埋标本所使用的AB 胶在室温条件下，完全固化需要1 d 左右。本文采用的UV 胶，在紫外光照射下发生紫外固化反应，凝固速度可控，节省成本，更适合于批量生产包埋标本。在本次小鼠标本的制作过程中使用太阳光照射，5 min 左右即可观察到表面固化现象，1 h 后即达到较好的固化效果，固化完成的包埋标本坚固又透明。

3 讨论

制作标本的原料尽可能选择幼体或体型较小的个体，因为成年个体的肌肉发达，各种试剂不易穿透，不利于标本制作。制作透明骨骼标本时梯度浓度浸泡是一种常用技术，在脱水固定步骤中，不使用无水乙醇直接浸泡标本的原因是该操作会使标本快速脱水而硬化皱缩，不利于美观和后续的实验操作[10]。

聚乙二醇在小型动物的简易塑化方面有着广泛地应用。这种水溶性高分子材料制作出的塑化标本具有防腐、防霉的特征[11-12]。

本研究不足之处是由于初次操作，制作完成的标本中含有微小的气泡。对此的解决方法是对标本进行紫外线照射之前，用真空泵除去气泡。并且由于丙酮脱脂不充分，小鼠的肩部脂肪没有去除干净，影响对颈椎的观察（图3）。在今后的制作过程中，将不断完善技术流程以制备更好的骨骼标本，以适应教学及商业化的要求。