环氧合酶-2在小鼠心肌缺血再灌注损伤中表达的时效及其作用

刘燕飞，李海燕，石刚刚

（汕头大学医学院药理学教研室，广东 汕头 515041）

缺血性心脏病是全球主要死亡原因之一。冠状动脉阻塞导致心肌缺氧和营养物质缺乏，直接造成心肌细胞死亡[1]，通过手术干预可以重建血管恢复血流，即再灌注可以降低心肌壁坏死的程度，同时也会诱发比再灌注前更为严重的心肌损伤，被称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。MIRI的病理机制复杂，常见的有钙超载、炎症[2]、活性氧的积累[3]、代谢紊乱以及能量障碍等。环氧合酶(cyclooxygenase，COX)是合成前列腺素的限速酶[4]。它有COX-1和COX-2两种同工酶。COX-1是结构酶，在大多数组织中呈组成型表达，维持细胞、组织和器官生理功能的稳定；COX-2是诱导酶，可以快速应答促炎介质、细胞因子、内毒素和脂多糖等的刺激，是触发炎症反应的关键环节。目前，COX-2在MIRI中扮演的角色存在争议。有研究发现在大鼠心脏缺血40 min再灌注24 h模型中，使用COX-2抑制剂塞来昔布治疗可以减少心肌梗死面积[5]。在离体研究中发现H9c2和大鼠原代心肌细胞缺氧再复氧前预孵COX-2抑制剂NS-398，可显著减轻缺氧再复氧诱导的心肌细胞损伤和凋亡[6]。在小鼠心脏缺血30 min再灌注24 h模型中，使用COX-2抑制剂NS-398治疗对心肌梗死面积无明显影响[7]。而且有关COX-2在小鼠MIRI中表达的时效尚未有文献报道。因此，本研究在小鼠整体水平结扎心脏冠状动脉左前降支建立MIRI模型，研究COX-2在MIRI中的表达时效，在此基础上通过COX-2基因敲除小鼠研究COX-2在MIRI中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 野生型C57BL/6JNifdc小鼠，SPF级，8～10周龄，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。使用此小鼠研究COX-2在MIRI中表达的时效。COX-2基因敲除小鼠由天津医科大学余鹰教授惠赠，在汕头大学医学院实验动物中心SPF级环境中饲养繁殖。后经基因鉴定出野生型小鼠及COX-2基因敲除小鼠用以研究COX-2在MIRI中的作用。本研究经汕头大学医学院实验动物伦理委员会审查批准。

1.1.2 主要试剂 COX-2抗体(美国CST公司)；β-Tubulin抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；HRP1标记山羊抗鼠IgG、HRP标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；2×Taq酶(美国Sigma公司)；COX-2基因引物(华大基因公司)。

1.1.3 主要仪器 ALC-V8S小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)；小型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；垂直电泳仪、PCR仪(美国Bio-Rad公司)；全自动乳化分散仪(上海净信实业发展有限公司)；Vevo®LAZR小动物多模成像系统(美国FujiFilm VisualSonics公司)；全自动血液生化分析仪(日本东芝公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠基因型鉴定 取COX-2敲基因小鼠一小块耳组织置于1.5 mL EP管底部，加入100 μL 25 mmol/L NaOH溶液(含2 mmol/L EDTA)，100 ℃沸水浴30 min后加入100 μL 40 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，振荡30 s以上，3 000 r/min离心10 s，取1.5 μL上清加至以下PCR反应体系：野生、敲除、杂合型COX-2基因引物各0.25 μL，2×Taq酶12.5 μL，H2O 10.25 μL，共计25 μL。PCR条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 4 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72℃7 min。取10 μL上样，用1.5%的琼脂糖胶进行DNA凝胶电泳。

1.2.2 小鼠MIRI模型的建立 小鼠称重，按每10 g体重0.1 mL的比例腹腔注射1%戊巴比妥钠。小鼠麻醉后，左胸前部脱毛，固定于手术台上，气管插管连接呼吸机，连接肢体导联心电图，剪开小鼠的皮肤、肌肉组织，在第3、4肋骨之间钝性分离，撕开心包膜暴露出心脏。在小鼠心脏冠状动脉左前降支穿线，垫入聚乙烯软管后进行结扎造成心脏缺血，以心电图ST段抬高，心尖部发白为缺血成功标志。取掉软管，剪开结扎线，以ST段下降为再灌注成功标志。模型(Model)组小鼠按上述方法缺血1 h再灌注4 h建立MIRI模型，假手术(Sham)组小鼠只穿线不结扎。

1.2.3 实验动物分组 时效研究分组：假手术组(Sham组)、缺血15 min组、缺血30 min组、缺血45 min组、缺血60 min组；Sham组、缺血1 h再灌注1 h组、缺血1 h再灌注2 h组、缺血1 h再灌注3 h组、缺血1 h再灌注4 h组、缺血1 h再灌注5 h组、缺血1 h再灌注6 h组。因果研究分组：野生型小鼠假手术组(WT Sham组)、COX-2基因敲除小鼠假手术组(KO Sham组)、野生型小鼠缺血1 h再灌注4 h组(WT Model组)、COX-2基因敲除小鼠缺血1 h再灌注4 h组(KO Model组)。

1.2.4 心肌总蛋白的提取 取小鼠心脏结扎线以下部分用生理盐水洗去多余的血液，用滤纸吸干后称重，置于1.5 mL EP管中，按100 mg心肌组织加1 mL裂解液的比例加入现配的RIPA裂解液(V裂解液∶VPMSF=50∶1)，把心脏组织剪碎，乳化分散仪研磨组织至无明显组织块，冰上静置30 min，每隔10 min振荡1次，然后13 000 r/min 4℃离心15 min，取上清210 μL于另一1.5 mL EP管中，取10 μL上清稀释50倍后用BCA法测蛋白浓度，剩余200 μL上清中加入5×蛋白上样缓冲液50 μL，沸水中煮5 min，室温冷却后-30℃保存备用。

1.2.5 Western blot检测COX-2蛋白表达 计算50 μg的蛋白量上样体积，将变性后的蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，先50 V恒压至样品过浓缩胶，然后将电压调至100 V跑分离胶约80 min，用湿转法将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，丽春红染色观察蛋白条带，切出目的条带及内参条带，用5%的牛奶封闭1 h，4℃过夜孵育COX-2一抗(1∶1 000稀释)。第2天条带先用TBST缓冲液洗3次，每次10 min，然后室温孵育二抗1.5 h，条带用TBST缓冲液洗3次，每次10 min。把条带放入暗盒，滴加发光液反应2 min，在暗房用X胶片压片，然后显影、定影。ImageJ图像分析软件分析蛋白条带的光密度。

1.2.6 小动物多模成像系统检测小鼠心功能 用异氟烷气体麻醉系统快速麻醉小鼠，把小鼠固定于操作板上，用脱毛膏将小鼠左胸前部毛发脱除干净，涂抹上适量的耦合剂，超声探头置于耦合剂上，调整探头位置使探头横切心脏长轴，分别保存M-Mode和B-Mode模式图像，用Vevo LAB 3.0.0软件分析实验结果。

1.2.7 小鼠血清心肌酶中肌酸激酶的检测 取小鼠血液约0.5 mL于1.5 mL EP管中，静置0.5 h，然后3 000 r/min 4℃离心10 min，取上清10 μL用生理盐水稀释64倍，取100 μL稀释后的样品于全自动血液生化分析仪检测肌酸激酶活性。

1.3 统计学方法

应用GraphPad Prism 5软件进行分析，正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COX-2在小鼠MIRI中表达的时效研究

2.1.1 心肌缺血时COX-2表达情况 随着缺血时间的延长，COX-2的表达逐渐升高，在缺血60 min时表达最高，与Sham组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1。

图1 小鼠心肌缺血期间COX-2的表达

2.1.2 心肌缺血再灌注时COX-2表达情况 心肌缺血1 h后随着再灌注时间的延长，COX-2的表达先逐渐升高，再灌注4 h达高峰后趋于稳定，与Sham组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图2 小鼠心肌缺血再灌注期间COX-2的表达

2.2 小鼠基因型鉴定

正常表达的COX-2基因完整DNA序列为800 bp，删除400 bp后造成基因突变，不表达COX-2基因。根据DNA凝胶电泳结果（图3），野生型小鼠仅有800 bp DNA条带，COX-2基因敲除小鼠仅有400 bp DNA条带。杂合子小鼠既有800 bp又有400 bp DNA条带，鉴定后予以剔除，不用于后续实验。

图3 DNA凝胶电泳结果

2.3 COX-2与MIRI的因果关系研究

2.3.1 COX-2基因敲除对MIRI的影响 WT Sham组和KO Sham组左室射血分数、短轴缩短率、左室舒张末期内径和左室舒张末期容积比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。与WT Sham组相比，WT Model组左室射血分数和短轴缩短率明显降低，左室舒张末期内径和左室舒张末期容积明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与WT Model组相比，KO Model组左室射血分数和短轴缩短率明显升高，左室舒张末期内径和左室舒张末期容积明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图4。

图4 COX-2基因敲除对缺血再灌注所致的小鼠心功能损伤的影响

2.3.2 COX-2基因敲除对缺血再灌注所致的肌酸激酶漏出的影响 WT Sham组和KO Sham组肌酸激酶活性比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。与WT Sham组相比，WT Model组肌酸激酶活性明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与WT Model组相比，KO Model组肌酸激酶活性明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图5。

图5 COX-2基因敲除对缺血再灌注所致的肌酸激酶漏出的影响

3 讨论

COX-2是诱导酶，在正常组织中表达较低，在不同的刺激下被强烈诱导[8]。越来越多的证据表明，COX-2在心肌缺血时高表达，提示COX-2的诱导可能参与缺血性心脏病[9]。有研究发现在MIRI动物模型中，缺血预处理后COX-2的表达对心脏具有保护作用[10-11]。但也有不少研究发现，COX-2表达的增强在心肌损伤的发展中起着有害的作用。在大鼠[5,12-13]、兔[14]和狗[15]等实验动物模型中，使用COX-2特异性抑制剂治疗可显著改善心功能，减少心肌梗死面积。

本研究发现正常情况下COX-2在小鼠心肌组织中低表达，心肌缺血后COX-2的表达逐渐升高，固定缺血时间为1 h，随着再灌注时间的延长，COX-2表达逐渐升高，于4 h达高峰后趋于稳定，表明虽然COX-2在心肌缺血时开始被诱导高表达，但再灌注对COX-2高表达的诱导更加明显。在此基础上观察野生型小鼠和COX-2基因敲除小鼠的心功能，正常情况下两种小鼠的左室射血分数、短轴缩短率、左室内径、左室容积和肌酸激酶基础值差异均无统计学意义，表明COX-2基因敲除后不影响小鼠正常心功能和肌酸激酶的漏出；在心肌缺血1 h再灌注4 h后，野生型小鼠左室射血分数和短轴缩短率明显降低，左室内径、左室容积和肌酸激酶漏出明显升高，与野生型模型组小鼠相比，COX-2基因敲除小鼠左室射血分数和短轴缩短率升高，左室内径、左室容积和肌酸激酶漏出明显降低，表明COX-2是造成小鼠MIRI的主要原因之一。

综上所述，随着小鼠心肌缺血或再灌注时间的延长，COX-2蛋白的表达呈时间依赖性地升高，COX-2的高表达是造成MIRI的重要原因，也是干预MIRI的潜在靶标。