钙非依赖型磷脂酶A2介导心肌缺血再灌注损伤

黄漫枝，蔡文锋，石刚刚

（汕头大学医学院药理学教研室，广东 汕头 515041）

缺血性心肌病是危害我国国民健康的重大疾病之一，及时溶栓或经皮冠脉介入术等方法进行再灌注是挽救缺血心脏的必需步骤，但该过程常伴随着严重的心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)，至今仍缺乏有效的干预手段。MIRI是一个复杂、多因子参与的病理过程，其病理机制目前尚不明确，可能与钙超载、氧化应激、能量代谢以及炎症反应等有关。

磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是具有甘油磷脂水解活性的一大类家族酶，其可在甘油磷脂的sn-2位置水解酰基键，产生游离脂肪酸和溶血磷脂[1]。PLA2大致可分为：分泌型PLA2、胞质型PLA2、不依赖 Ca2+的 PLA2(Ca2+-independent PLA2，iPLA2)和血小板活化因子乙酰水解酶四大类。iPLA2可水解膜磷脂生成花生四烯酸和溶血磷脂酰胆碱[2-3]。花生四烯酸可以在再灌注阶段促进炎症反应[4]，而溶血磷脂酰胆碱被认为有致心律失常的作用[5]，造成心肌细胞钙离子超载，影响心脏的机械与代谢活动。有文献[6]报道，在缺血心肌中iPLA2对缩醛磷脂的活性增加了10倍，缺血5 min后iPLA2活性达到最高并持续了1 h。我们前期在离体实验中发现心肌细胞缺氧再复氧过程中，心肌细胞转染iPLA2质粒使iPLA2高表达后的缺氧再复氧损伤加重；转染iPLA2-siRNA沉默iPLA2基因，缺氧再复氧损伤减轻，表明iPLA2参与心肌细胞的缺氧再复氧损伤[7]。本研究拟在整体心肌缺血再灌注模型上探讨iPLA2表达的时效性，并借助于iPLA2基因敲除方法，确证iPLA2与MIRI的因果关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6JNifdc小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，iPLA2-/-的C57BL/6JNifdc小鼠由赛业(苏州)生物科技有限公司构建，饲养于汕头大学医学院实验动物中心，由本课题组成员饲养繁殖并鉴定基因型。本研究经汕头大学医学院实验动物伦理委员会审查批准。

1.1.2 主要试剂和仪器 戊巴比妥钠购自德国Merck公司；iPLA2兔多克隆抗体购自美国Cayman公司；Tubulin鼠多克隆抗体购自北京中杉金桥公司；CD68小鼠多克隆抗体购自英国Abcam公司；HRP标记山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG、Cy3标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自上海碧云天公司。小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)；Vevo LAZR小动物多模成像系统(加拿大Fujifilm VisualSonics公司)；CM1850冰冻切片机(德国Leica公司)；TBA-40FR全自动生化分析仪(日本Toshiba公司)；Olympus BX53正置荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠基因型鉴定 将小鼠作好标记后采集小鼠鼠尾，保存于EP管中，按DNA提取试剂盒提取总DNA，PCR反应体系如下：94℃3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃10 min。取10 μL上样，用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，40 min后观察DNA条带。

1.2.2 小鼠心肌缺血再灌注模型的建立 8～10周龄的小鼠禁食12 h后称重，腹腔注射1%的戊巴比妥钠(60 mg/kg)进行麻醉。将小鼠通过气管插管连接呼吸机，呼吸频率115，呼吸比1.3∶1，潮气量2.0。在小鼠第3和第4肋骨间开胸暴露心脏，撕开心包膜后明显观察到左心耳位置。使用8-0的带针缝线结扎左前降支，造成心肌缺血。缺血结束后松开结扎线，进行相应时间的再灌注，建立心肌缺血再灌注模型。

1.2.3 实验分组 采用随机数字表法随机分组。(1)C57BL/6JNifdc小鼠随机分成5组：假手术组(sham组)、不同时间缺血组(15、30、45、60 min)，每组各6只。(2)C57BL/6JNifdc小鼠随机分成8组：sham组、缺血45 min后不同时间再灌注组(0.5、1、2、3、4、5、6 h)，每组各6只。(3)野生型C57BL/6JNifdc小鼠和iPLA2-/-C57BL/6JNifdc小鼠随机各分为2组：sham组和缺血45 min再灌注3 h组，每组各6只。

1.2.4 免疫荧光法观察CD68的表达 将小鼠心脏置于冰上，制作厚度8 μm冰冻切片，于冰上用4%多聚甲醛中固定15 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5 min，用免疫荧光封闭液室温封闭1 h。滴加50 μL 稀释后的CD68抗体(V抗体∶V封闭液=1∶50)，于4℃孵育过夜。第2天常温下复温30 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5 min。以下步骤都需避光。滴加50 μL稀释后的Cy3标记山羊抗小鼠IgG荧光二抗(1∶1 000稀释)，室温孵育1 h，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5 min，DAPI染核5 min，磷酸盐缓冲液冲洗5 min，滴加抗荧光猝灭封片液，于荧光显微镜下观察结果。通过计算每组中CD68阳性表达细胞数所占的比例进行统计分析。

1.2.5 蛋白质印迹法检测iPLA2蛋白的表达水平 提取小鼠心肌组织蛋白：按100 mg心肌组织加1 mL蛋白裂解液的比例加入预冷的蛋白裂解液，用乳化分散仪进行组织匀浆，冰上静置30 min，4℃12 000 r/min离心15 min后收集上清液。BCA法进行蛋白定量后按4∶1的比例加入5倍上样缓冲液，煮沸5 min变性；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(50 V)至分离胶后，更换100 V电压继续电泳1 h；电转膜法将蛋白转移到硝酸纤维素膜；5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h；ECL化学发光后曝光；Gel-Pro图像分析软件分析蛋白条带的灰度值。

1.2.6 全自动生化分析仪检测小鼠血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的活性 将小鼠血清用生理盐水分别稀释64倍、16倍、16倍，每个稀释后的样本吸取100 μL于检测管，用TBA-40FR全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase， LDH)、 肌 酸 激 酶 (creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB)活性。

1.3 统计学分析

应用SPSS 18.0统计软件进行分析。计量资料经K-S正态性检验符合正态分布，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠心肌缺血再灌注时iPLA2蛋白表达的时效变化

与sham组相比，随着缺血时间的延长，iPLA2的表达逐渐升高，且在缺血45 min时达到峰值，差异具有统计学意义(P＜0.05)，缺血60 min时iPLA2的表达较45 min略有下降，但差异无统计学意义(P＞0.05)，如图1A所示。与sham组相比，当缺血时间固定为45 min时，随着再灌注时间的延长，iPLA2蛋白的表达逐渐升高，再灌注3 h时达到峰值，差异具有统计学意义(P＜0.05)，再灌注4、5、6 h时iPLA2的表达较再灌注3 h略有下降，但差异无统计学意义(P＞0.05)，如图1B所示。因此，选择缺血45 min再灌注3 h作为后续研究模型制作的时间点。

图1 小鼠心肌缺血再灌注时iPLA2蛋白表达的时效变化

2.2 iPLA2在小鼠MIRI中的作用

2.2.1 iPLA2基因敲除小鼠的鉴定 iPLA2基因敲除小鼠的构建方法是敲除iPLA2所在PLA2G6基因的2 817 bp。如图2所示，杂合子小鼠显示出526 bp和573 bp两个条带，纯合子小鼠即iPLA2基因敲除鼠仅有526 bp条带，而野生型小鼠仅有573 bp条带。纯合子小鼠和野生型小鼠用于后续实验，杂合子小鼠予以剔除，不用于后续实验。

图2 iPLA2基因敲除小鼠的基因型鉴定

2.2.2 iPLA2基因敲除能改善心肌缺血再灌注后血清酶的漏出 野生型小鼠sham组与iPLA2-/-小鼠sham组相比血清酶活性差异无统计学意义(P＞0.05)；与野生型小鼠sham组相比，野生型小鼠在缺血再灌注后，CK、CK-MB和LDH的漏出增多，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与野生型小鼠缺血再灌注组相比，iPLA2-/-小鼠缺血再灌注后CK、CK-MB和LDH的漏出减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)，如图3。

图3 iPLA2基因敲除改善心肌缺血再灌注后血清酶的漏出

2.2.3 iPLA2基因敲除能改善MIRI中的炎症反应 如图4所示，图中的蓝色荧光代表细胞核，红色荧光代表CD68阳性细胞，通过计算CD68阳性表达的细胞数所占的比例来评价组织中巨噬细胞的多少。野生型小鼠sham组与iPLA2-/-小鼠sham组相比差异无统计学意义；与野生型小鼠sham组相比，野生型小鼠心肌缺血再灌注后，心肌组织中CD68标记的炎症细胞增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与野生型小鼠心肌缺血再灌注组相比，iPLA2-/-小鼠心肌缺血再灌注后心肌组织中CD68标记的炎症细胞表达减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图4 iPLA2基因敲除对心肌缺血再灌注后CD68表达的影响

3 讨论

本研究显示在小鼠MIRI中，iPLA2的表达上调，其表达的峰度与缺血或再灌注时间密切相关。这与本课题组前期对于细胞水平的研究结果是一致的[8]。活化的iPLA2可以水解肌膜磷脂造成脂肪酸在细胞膜上的积累和溶血磷脂酰胆碱的释放增加。这两种产物具有多种效应，介导不同信号通路而产生不利于损伤恢复的反应，通过参与离子通道的调节对一系列炎症、凋亡等反应产生作用，尤其在MIRI中发挥重要作用。Mancuso等[9]采用Langendorff方法制作缺血模型，发现过表达iPLA2小鼠在缺血几分钟内即可发生恶性室性快速心律失常，给予iPLA2抑制剂后的转基因小鼠发生恶性室性快速心律失常的概率降低。Moon等[10]的研究表明，与野生型小鼠比较，iPLA2γ敲除小鼠在心肌缺血再灌注模型中，其梗死面积明显减少。由此我们合理地推测iPLA2不但是心肌缺血还是再灌注损伤中的重要因子。本研究借助于iPLA2基因敲除小鼠，以心肌损伤的几个标志性血清酶为参数，证明了iPLA2蛋白的高表达是MIRI的重要原因。

CD68所标记的炎症细胞代表组织中的巨噬细胞，巨噬细胞在免疫反应中扮演了很重要的角色，其对细胞残片及病原体进行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴细胞或其他免疫细胞，参与到免疫反应中。本研究中iPLA2-/-小鼠MIRI中的炎症反应与野生型小鼠比较得到明显改善，表现为CD68标记的炎症细胞表达减少。这可能与iPLA2的产物花生四烯酸可以在再灌注阶段促进炎症反应有关。炎症反应是MIRI中主要病理现象之一，Nelson等[11]的研究用脂多糖刺激从野生型小鼠和iPLA2-/-小鼠分离的巨噬细胞，发现前列腺素E2在iPLA2-/-小鼠分离的巨噬细胞中表达减少，表明iPLA2影响了巨噬细胞的功能。而本研究则进一步发现，iPLA2还可以增加缺血区巨噬细胞的浸润数量而加重炎症反应。

综上所述，本研究从整体水平上说明了敲除iPLA2基因后对小鼠MIRI具有保护作用，因此在MIRI中，具有选择性和生物可利用性的iPLA2抑制剂可作为一种潜在的治疗工具。