自噬调控消化道肿瘤生长的研究进展

何玉鑫，张尤历，李非凡，徐 岷

江苏大学附属医院消化内科，江苏 镇江 212000

真核细胞中有两个主要的降解系统：溶酶体和蛋白酶体。自噬就是依赖于溶酶体进行的细胞内物质(细胞器、病原体和蛋白质)自我消化再利用的过程。消化道肿瘤占我国高发恶性肿瘤的“半壁江山”，总体治疗效果欠佳，预后差。研究[1]表明，自噬可能参与调控消化道肿瘤的发生发展。一方面，自噬通过清除致癌因素抑制消化道肿瘤生长的启动；另一方面，自噬通过诱导各种应激适应促进消化道肿瘤的增殖。本文将对消化道肿瘤发展过程中自噬的作用机制展开描述，为消化道肿瘤的防治提供新的思路。

1 自噬的分子机制

自噬的过程可分为以下几个步骤：首先细胞收到自噬信号后，形成了一个双层或多层的膜结构(被称为Phagophore)，其次Phagophore不断扩张包裹细胞器和细胞质成为密闭球状自噬体(autophagosome)，最后自噬体和溶酶体结合形成自噬溶酶体(autolysosome)降解内容物。根据细胞物质运送到溶酶体内的途径不同，自噬分为巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬；根据选择性降解的底物不同，自噬又被分别命名为线粒体自噬、过氧化物酶体自噬、异种自噬等。本文主要涉及消化道肿瘤中巨自噬的研究。一般情况下，通过检测自噬相关蛋白的表达量可以判断自噬活性，如LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达量与自噬活性呈正相关，p62/SQSTM1表达量与之相反。同样，电镜拍摄也可以捕获自噬的动态过程，但值得注意的是，自噬中间产物(自噬体)的增多，不能代表自噬降解的真正增加，如干扰自噬体和溶酶体的结合，会导致自噬体累积，实际上是抑制了自噬的发展过程。

多种重要的分子及信号通路参与了自噬途径。mTOR激酶是调控自噬的第一步，它包含两种复合体mTORC1和mTORC2，其中参与自噬的主要是mTORC1。激活的mTOR(PI3K/Akt和MAPK信号传导)可抑制自噬，而mTOR的负性调节(AMPK和p53信号传导)则促进自噬。被mTOR抑制的下游ULK1复合体(ULK1、ULK2、自噬基因Atg13、骨架蛋白FIP200)联合Ⅲ级PI3K复合体(Beclin-1/Atg6、Vps15、UVRAG和Ambra1)主要负责诱导自噬泡外层膜的生成。而Atg5-Atg12-Atg16L复合物、LC3-Ⅱ与自噬泡结合进一步促成自噬体形成[2]。同时，自噬通路与其他通路存在交互作用，如促凋亡信号肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptisis inducing ligand,TRAIL)和Fas相关死亡域蛋白(Fas-associating protein with a novel death domain,FADD)可以诱导自噬，而抗凋亡因子Bcl-2则抑制Beclin-1依赖性自噬[3](见图1)。

图1 自噬过程示意图Fig 1 Autophagy process diagram

2 自噬抑制消化道肿瘤发展

一般认为，在消化道肿瘤发生的早期阶段，自噬通过清除致癌基因、诱导抗炎抗感染、刺激免疫应答、介导细胞死亡或衰老等发挥了肿瘤抑制作用。

2.1 自噬清除致癌基因一些参与消化道肿瘤发展的致癌基因已被证明可以通过自噬清除，如p62和突变型p53。p62在多数消化道肿瘤中表达上调，其由SQSTM1编码，可以通过自噬降解。Zhang等[4]发现，低表达的RNA结合蛋白DDX5(DEAD-Box Helicase 5,又称p68)伴随高表达的p62与肝癌患者肿瘤的形成和低生存率相关，DDX5通过与p62相互作用介导自噬激活、减少p62积累，进而抑制肝癌细胞的增殖。而p53原本是一种抑癌基因，p53的突变不仅使其丧失肿瘤抑制功能，还有可能获得新的致肿瘤特性。并且突变的p53能够逃避蛋白酶水解，这更加利于肿瘤的进展。Shen等[5]首次报道了胃癌细胞中过表达的S100A4蛋白(一种可促进肿瘤转移、细胞增殖的蛋白)与突变型p53存在相互作用。S100A4基因敲除增加了突变型p53相关的自噬和细胞分化，导致突变体p53V143A的表达降低。由此推测自噬通过消除突变型p53V143A抑制胃癌细胞生长。

2.2 自噬诱导抗炎抗感染炎性微环境会刺激恶性转化，导致癌症发生。充分的自噬反应通过干扰炎症小体的产生，限制促炎信号的传导起到抑癌作用。Guo等[6]在诱导小鼠结肠癌模型中发现小分子穿心莲内酯(Andro)通过触发线粒体吞噬，导致线粒体膜电位反转，进而使核甘酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎性体失活，促炎性细胞因子IL-1β分泌减少，改善了小鼠结肠炎相关癌症的发生，而自噬相关基因Beclin-1的敲除以及自噬抑制剂氯喹的使用能显著消除Andro的抗炎作用。随后，Sun等[7]也证实了自噬缺陷的Kupffer细胞在癌前阶段通过增加线粒体ROS-NF-κB-IL-1α/β途径，促进了肿瘤炎症形成及纤维化，最终导致肝癌发生。同样，自噬在抵抗病毒和细菌感染方面也发挥着重要作用。目前已知几种潜在的致肿瘤病原体在感染后会有效激活自噬，如乙型肝炎病毒(肝癌)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EB病毒)和幽门螺杆菌(胃癌)、牛链球菌(大肠癌)、肠炎沙门氏菌(克罗恩氏病、大肠癌和胆囊癌)等，可能是入侵的微生物与宿主细胞之间的营养竞争促使了这种异种自噬[1]。

2.3 自噬刺激免疫应答自噬在肿瘤的免疫监测中起着关键作用。自噬可以在激活模式识别受体(PRRs)的同时直接清除细胞内病原体，并促进细胞因子分泌和吞噬作用来参与先天性免疫反应，如致肿瘤病原体引起的异种吞噬。自噬还能通过调节抗原提呈细胞稳态，增加抗原提呈来参与适应性免疫反应[8]。Yu等[9]发现，肝细胞癌(HCC)衍生的自噬小体(Dribbles)含有大量的HCC抗原，树突细胞与Dribbles联合诱导了针对HCC的特异性T细胞反应，并显著抑制了HCC细胞生长。而Ma等[10]在自噬缺陷的肝细胞中发现脂质多聚体的积累，这可能会促进亚油酸的释放，导致肝CD4+T细胞的耗竭并产生促进HCC生长的免疫抑制微环境。某些病毒、化学制剂会激活自噬，从而上调损伤相关的分子模式(DAMPs)和肿瘤抗原，通过激活抗原提呈细胞、增强抗原与特异性T细胞的交叉呈递，促进CTL肿瘤杀伤力，因此诱导自噬增强免疫可能是新的抗肿瘤疗法[8]。

2.4 自噬性细胞死亡和自噬介导的癌基因诱导细胞衰老近年来，研究人员提出了自噬性细胞死亡(autophagic cell death，ACD)的概念，并将其定义为是由增强的自噬通量而不是细胞凋亡或程序性坏死所介导的细胞死亡过程[11]。Kim等[12]发现，山萘酚通过IRE1-JNK-CHOP途径介导Bcl-2-Beclin-1解离并且诱导胃癌细胞自噬性细胞死亡，自噬抑制剂3-MA可以显著阻断LC3-Ⅱ的表达和细胞死亡，这对于早期癌症来说可能是一种新的抗癌方式。除了自噬性细胞死亡外，通过癌基因诱导的细胞衰老(oncogene-induced senescence，OIS)也具备一定的抗癌作用,它是细胞用来抑制良性肿瘤向恶性进展的一种机制，常发生在癌前病变中。Galluzzi等[13]提出自噬的激活是建立OIS所必需的，核纤层蛋白B1(LMNB1)与LC3之间的相互作用触发了细胞衰老。现已证实胰腺癌[14]、肝癌[15]中存在OIS介导的肿瘤抑制作用。Cho等[16]也认为Sox2靶向Atg10激活的自噬通过诱导结肠癌HCT116细胞的衰老抑制增殖。ACD和OIS在消化道肿瘤中的报道不多见，也许这并不是自噬抑制消化道肿瘤发展的最常见机制。

3 自噬促进消化道肿瘤发展

在肿瘤发展的后续阶段，自噬促进消化道肿瘤发展。在缺血、缺氧、代谢紊乱的肿瘤微环境中，自噬激活能帮助癌细胞克服这些压力继续增殖，促进恶性转化或放化疗抵抗。

3.1 自噬增强肿瘤细胞代谢功能相比于正常组织，肿瘤中表现出异常的自噬活性。为满足肿瘤细胞特殊的能量需求，自噬可以通过增强代谢为细胞提供生物能和生物合成底物，从而维持能量稳态[17]。Fan等[18]激活HCC中的自噬发现葡萄糖的消耗和乳酸的产生增多，通过检测了HCC中几种代谢酶发现其中负责丙酮酸运输的单羧酸转运蛋白1(MCT1)明显增加，自噬通过激活Wnt/β-catenin信号传导促进MCT1表达，增加HCC中的糖酵解。同样，自噬介导了癌细胞对脂肪酸的利用，Wen等[19]将脂肪细胞与结肠癌细胞共培养，发现结肠癌细胞摄取脂肪细胞分泌的脂肪酸，脂肪细胞和脂肪酸通过激活结肠癌细胞中的AMPK信号传导来改变细胞代谢，而自噬的抑制减弱了癌细胞利用脂肪酸的能力并阻止了癌细胞的生长。此外，癌细胞中谷氨酰胺分解和自噬之间的联系也值得注意，Zhang等[20]发现，谷氨酰胺分解的上调为胃癌细胞提供了能量优势，但miR-133a-3p的过表达阻断了自噬介导的谷氨酰胺分解进而抑制癌细胞生长和转移。

3.2 自噬介导肿瘤细胞缺氧适应正常情况下，缺氧会导致细胞坏死、凋亡。但在肿瘤组织中，缺氧却能通过诱导自噬促进癌细胞的增殖。Lai等[21]发现，缺氧通过激活PERK信号通路和失活mTOR信号通路增加结肠癌HCT116细胞中溶酶体蛋白的翻译，诱导线粒体自噬，增强癌细胞缺氧适应能力。Toshima等[22]首次报道了低氧状态下，HCC细胞通过激活线粒体β-氧化来维持细胞内三磷酸腺甘(ATP)稳态，这可能也是由于自噬激活清除受损的线粒体所导致的。低氧环境除了引起癌细胞自身缺氧适应，也会对肿瘤周围细胞产生影响。Li等[23]报道，细胞外基质蛋白基膜聚糖(Lumican)对胰腺导管癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)细胞增殖有抑制作用，间质高表达Lumican的PDAC患者治疗后的生存期更长。实验证明，缺氧诱导因子(HIF-1α)和AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)激活诱导基质细胞的自噬，导致Lumican降解，从而促进了PDAC细胞的生长。这表明低氧条件下，基质细胞的自噬促进癌细胞生长。

3.3 自噬促进肿瘤血管生成、诱导细胞迁移肿瘤血管较正常的血管显示出高渗透性，低稳定性和不同的直径。这些薄弱的结构特征导致血流中断，并限制氧气和营养物质的可及性。在这种情况下，内皮细胞通过自噬刺激血管生成来摆脱这些压力[24]。Zeng等[25]发现过表达miR-9的HCC相关内皮细胞(endothelial cells，EC)诱导自噬并且通过激活内皮生长因子(VEGF)的释放，促进了EC血管生成。在使用抗血管生成剂后，EC还能释放富含VEGF的外泌体，刺激HCC细胞的集落形成和血管生成拟态(vascular malformation，VM)，VM是肿瘤细胞获得内皮样属性形成输送血液的管道系统的特殊肿瘤微循环。自噬抑制剂则阻止了miR-9诱导的VEGF的表达和释放，抑制了VM的形成。癌细胞的转移是癌症难治的另一因素，通过自噬获得能量使癌细胞运动力增强，而细胞粘附信号的改变，进一步导致细胞迁移。研究表明，自噬与调节细胞运动的黏着斑激酶(FAK)、FIP200和桩蛋白(PXN)、Rho GTPases存在相互作用[26]。Wang等[27]发现，肿瘤机械微环境中的流体剪切应力(FSS)诱导HCC发生的过程中自噬增加，细胞内PI3K(Ⅲ)和FAK表达，Ras蛋白质超家族的成员Rho GTPases(RHOA、RAC1和CDC42)表达也上调。自噬抑制剂3-MA的加入明显降低了上述蛋白质的水平，同时抑制了细胞的迁移能力。由此可见，自噬在支持血管生长和肿瘤细胞远处转移方面起推进作用，并且自噬抑制剂有可能成为辅助治疗的手段。

3.4 自噬促进肿瘤细胞干性维持肿瘤干细胞(CSC)占总体癌细胞的一小部分，具有自我更新、分化和肿瘤形成的特殊能力，而自噬促进了CSC的生长及干性维持。Yang等[28]提出由骨桥蛋白(OPN)/核因子κB(NF-κB)信号介导的自噬增强了胰腺CSC活性，抑制自噬提高了吉西他滨的肿瘤杀伤力。类似的，Wang等[29]在HCC中发现，lncRNA HULC通过上调沉默调节蛋白1(Sirt1)的表达诱导细胞自噬，同时肝CSC中细胞周期调节蛋白D1(Cyclin D1)和pRB的表达也上调，加速了肝CSC的生长。自噬除了参与CSC的生长，还赋予癌症细胞干性表型。Zhao等[30]分别用普通培养基和癌症相关的成纤维细胞(cancer associated fibroblast，CAF)的上清液来培养肝癌Huh7细胞。结果发现，用上清液培养的Huh7细胞与对照组的细胞相比，形成了更多的球形和集落且具有更高的自噬水平，并且自噬抑制剂的使用减少了CAFs诱导的干性相关蛋白的表达，可见CAFs诱导的干性表型是自噬介导的。

3.5 自噬诱导肿瘤细胞放化疗抵抗肿瘤细胞暴露于化疗药物和放射治疗后诱导了自噬的发生，自噬通过减少细胞内药物浓度、阻断凋亡信号传导、修复DNA损伤来降低治疗敏感性[31]。多耐药基因1(MDR1)表达产物是P-糖蛋白，该蛋白有ATP依赖性跨膜转运活性，可将药物转运至细胞外。Shuhua等[32]发现，结肠癌中MDR1表达水平与自噬相关基因Beclin-1、Rictor的表达水平呈正相关，提示了自噬与结直肠癌耐药的发生有关。自噬与凋亡通路的串扰可能是导致耐药的另一个因素，Fitzwalter等[33]在结肠癌模型中发现，自噬抑制剂可以通过上调自噬调节转录因子FOXO3a促进凋亡基因BBC3/PUMA的转录，导致凋亡敏感，从而改善依托泊苷和阿霉素抗癌效果。在电离辐射等刺激下，细胞还会发生DNA损伤，自噬可能通过诱导损伤修复维持癌细胞功能。Alotaibi等[34]观察到接受辐照的结肠癌HCT116细胞在生长停滞一段时间后恢复了增殖能力。他们发现辐射引起癌细胞DNA损伤的同时伴随着自噬/衰老的增加，被诱导自噬/衰老的HCT116细胞具有修复新形成的DNA双链断裂(DSB)的能力，并且能继续增殖。既往研究[35]已证明，自噬可改变细胞对DNA损伤剂的反应，如6-硫鸟嘌呤诱导的自噬增强了人类结直肠和子宫内膜细胞的存活，但自噬是如何参与DNA修复未明确阐述不清楚，具体机制有待进一步探索。

4 前景与挑战

自噬对消化道肿瘤的作用与肿瘤代谢、肿瘤微环境、肿瘤异质性有很大相关性。鉴于自噬的诱导或抑制能干扰肿瘤的发展，自噬调节剂与放化疗方案联合使用可能会提高肿瘤治疗效果。目前使用的许多自噬调节剂既缺乏特异性，且存在潜在毒性，临床应用并不广泛。研发选择性更好的自噬调节剂，以及根据消化道肿瘤的结构特征及发展阶段制定精准的治疗方案，是进一步研究的重点。自噬对消化道肿瘤生长的调控十分复杂，还可能存在其他机制，这仍需更多的研究去验证。