宿主感染马红球菌的免疫机制

冯婷婷， 徐兆坤， 郝秀静， 张 颖， 李 敏*， 罗海霞*

(1．宁夏大学 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021；2．宁夏大学 生命科学学院，宁夏 银川 750021)

马红球菌(Rhodococcusequi)，作为一种人兽共患病原菌[1]，主要引起3～6月龄马驹亚急性或慢性脓肿性支气管肺炎，致死率高达80%以上[2]。作为一种人体机会性致病菌，马红球菌主要感染免疫缺陷患者，其中约80%的临床特征表现为肺部疾病，病死率超过50%[3]。此外，马红球菌还可以感染猪、羊、猫、狗、骆驼等其他动物[4-8]。马红球菌感染后，其通过抑制吞噬体/自噬体与溶酶体的融合从而抵抗巨噬细胞的杀伤，导致肺部组织的破坏以及中性粒细胞大量涌入，最终发展为坏死性肺炎[9]。目前针对马红球菌肺炎的防治尚无有效疫苗可以使用，只能使用抗生素进行联合治疗，但由于耐药菌株的出现使得马红球菌肺炎的防治面临更艰难的挑战[10]。因此，研究马红球菌与宿主免疫细胞的相互作用对于探索该菌的致病机制非常重要。本文就宿主感染马红球菌的免疫机制进行概述，旨在为该菌所引发疾病的防治策略提供参考。

1 马红球菌及其感染

马红球菌属放线菌目、诺卡菌科、红球菌属。该菌是一种革兰阳性兼性胞内寄生菌，菌落为粉色或黄色(图1),棒状或球形，耐酸，无孢子，大多无鞭毛，但有些菌株有菌毛或附肢。马红球菌的细胞壁具有疏水性且被多糖荚膜所围绕(图2)，其细胞壁的主要成分为富含霉菌酸(Mycolic acids)的脂质和脂多糖，其中脂多糖为海藻糖二甲酸酯(Trehalose dimycolate，TDM)和脂阿拉伯糖甘露聚糖(Lipoarabinomannans，LAM)[11-13]。从被感染的动物体内分离到的致病性马红球菌均携带1个80～85 kb大小且具有宿主特异性的毒力质粒[14]。毒力质粒按功能可分为致病岛、复制岛和共轭岛。马红球菌的致病性主要表现在其毒力质粒致病岛上毒力基因所编码的毒力相关蛋白(Virulence associate protein，Vaps)。研究发现，vap家族基因的表达受温度、pH、氧化应激、镁离子以及铁离子等外界因素的调控。同时，VirR/VirS双组分调节系统也控制vapA及致病岛上其他基因的表达[15]。

图1 LB固体培养基上马红球菌的菌落形态Fig.1 Colony morphology of R.equi on LB solid medium

图2 马红球菌的透射电镜下的超微结构形态[25]Fig.2 Ultrastructural morphology of R.equi in electron microscopy[25]

马红球菌广泛存在于土壤中，同时也可以在草食动物粪便和大肠中繁殖，通过粪口途径在农场栖息地中传播，该菌感染的主要宿主为3～6月龄马驹和免疫缺陷患者，同时，还可以感染猪、羊、猫、狗、骆驼等其他动物。马驹感染早期的临床症状表现为轻度发烧或呼吸频率增加，发展为肺炎时，表现为食欲下降、昏睡、发烧和呼吸急促、咳嗽，两侧鼻孔排出脓液，致死率极高[9]。与此同时，马驹的种群密度、农场栖息地的管理和环境因素(如温度、湿度和土壤pH)对于该病原菌的传播具有很大的影响，大多数马红球菌感染病例是在干燥温暖的夏季诊断的，此时不仅具备细菌繁殖的最佳条件，而且还会使马驹容易吸入被污染的粉尘颗粒，从而增加被感染的风险[16]。在我国，内蒙古自治区锡林郭勒盟大草原和呼伦贝尔大草原土壤中马红球菌的分离率为25.9%～30.0%, 通辽近郊则高达82.3%[17]。在广东省部分马场中，马匹马红球菌病抗体检出阳性率及土壤中马红球菌的平均菌量均高于世界其他国家及地区。而蒙古国乌兰巴托的马群中则未分离到马红球菌，造成这一差异主要是因为内蒙古自治区的牧民不再使用传统的流动式放牧，而是通过圈养的方式发展畜牧业。此外，统计学分析显示马红球菌在土壤中的分布与马匹活动有关，与季节、地理位置等其他因素无明显相关性[18-20]。人感染马红球菌的案例在我国的云南、广西、广东、湖南等地区均有报道，感染者多为免疫缺陷患者[21-24]。

2 马红球菌与固有免疫

马红球菌感染后，宿主通过固有免疫细胞对马红球菌进行免疫应答，同时为激活获得性免疫应答提供准备[16]。此部分主要讨论了巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞对马红球菌的抗感染作用。

2.1 马红球菌与巨噬细胞的相互作用

巨噬细胞(Macrophages，MØ)是抵抗胞内菌感染的第一道防线，是固有免疫和适应性免疫不可或缺的重要细胞。其发挥的免疫功能有吞噬和清除病原体、对抗原进行加工和提呈、释放多种细胞因子等[26]。马红球菌因其兼性胞内寄生菌的特性，可在巨噬细胞中存活并增殖。

病原菌入侵宿主后，巨噬细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别病原体的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)不仅是适应性免疫应答的开始，也是调节先天性免疫应答的关键。由于膜识别受体不同，马红球菌入侵后在宿主内的感染机制也不同[11，27-28]。Toll样受体作为激活宿主天然免疫重要的PRRs，在对病原菌的免疫清除中起着关键作用[29-30]。马红球菌感染之后，宿主巨噬细胞会经历NF-κB的移位，并通过Toll样受体2(TLR2)激活多种促炎介质产生，例如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-12(IL-12)以及一氧化氮(NO)[31-32]。马红球菌进入巨噬细胞还需要补体受体和甘露糖受体，其中补体受体主要由白细胞补体受体3型(CR3)和MHC-Ⅰ所介导。该病原菌可以直接利用其细胞膜表面的马红球菌-阿拉伯糖甘露聚糖(ReqLAM)与巨噬细胞的甘露糖受体结合而进入巨噬细胞，重组甘露糖结合蛋白可通过凝集素途径激活补体系统，使C3b在重组甘露糖上沉积，从而促进马红球菌通过MHC-Ⅰ介导的途径进入巨噬细胞[33]。

巨噬细胞吞噬病原菌之后，还可以与溶酶体融合，利用溶酶体的酸性环境将病原菌清除。马红球菌被巨噬细胞吞噬后可形成包含马红球菌的吞噬泡(R.equi-containing vacuole，RCV)，其通过破坏巨噬细胞的吞噬机制，可以在巨噬细胞中进行复制[39-40]。在此过程中，马红球菌毒力质粒中，vapA编码的毒力相关蛋白A(Virulence associated protein A，VapA)起着至关重要的作用，VapA敲除的马红球菌突变株会丧失在巨噬细胞中复制的能力[41]。2019年Von Bargenk等[42]的研究发现，马红球菌被巨噬细胞吞噬后，VapA可以转移到吞噬体膜上，抑制质子泵ATP酶(Proton-pumping vacuolar ATPase，vATPase)的功能，另外VapA也可以转移到溶酶体膜上，破坏膜通透性和质子梯度，引起晚期溶酶体功能紊乱，抑制吞噬体/自噬体与溶酶体融合，形成pH呈中性的环境，从而促进马红球菌在细胞内的生长。

2.2 马红球菌与树突状细胞的相互作用

树突状细胞(Dendritic Cells，DC)作为机体联系固有免疫和适应性免疫的重要桥梁，其抗原提呈能力强，并且可以调控T淋巴细胞的分化及免疫应答，因此在机体清除病原菌感染中起着重要作用[43-44]。但是，某些病原菌也会进化出逃逸宿主树突状细胞免疫清除的机制，例如沙门氏菌不仅可以抑制树突状细胞所介导的抗原提呈逃避宿主的免疫清除[45]，还可以通过上调树突状细胞SIRT2的表达，导致NF-κB p65移位到细胞核，上调NOS2的基因转录和NO的产生，NO最终通过抑制T细胞的增殖从而帮助沙门氏菌逃逸宿主的免疫清除[46]。除巨噬细胞外，树突状细胞也参与了宿主早期对马红球菌感染的抵抗。类似于结合分枝杆菌与树突状细胞的相互作用，马红球菌在感染宿主之后，树突状细胞会诱导T淋巴细胞分化为细胞毒性T细胞对病原菌进行清除，同时也会激活巨噬细胞的杀菌功能[47]。

树突状细胞可以通过MHC-II类分子、CD86等提供的共刺激信号进行抗原提呈，还可以诱导T细胞的分化，但未成熟的树突状细胞诱导T细胞分化的能力较差[43]。小鼠的树突状细胞在其1周龄时，由于缺少CD80、CD86和CD11c的表达，递呈抗原的能力较低[48]。马驹树突状细胞的MHC-II的表达量较低，可能是导致宿主树突状细胞的抗原呈递能力下降的原因[47]。Mérant等[49]发现，与成年马相比，2～3周龄马驹的树突状细胞表面分子CD14+、CD1w2+、CD86+的表达量下降，随着马驹生长至3个月时，CD14+、CD1w2+、CD86+的表达量增加，这表明2～3周龄马驹的树突状细胞的免疫能力可能存在缺陷；细胞因子检测的结果表明，IL-1、IL-12、IL15和IL-18的mRNA表达在成年马与马驹中没有差异。综上，马驹容易成为马红球菌的易感宿主可能是因为其树突状细胞功能存在年龄依赖性缺陷。

2.3 马红球菌与中性粒细胞的相互作用

中性粒细胞(Neutrophils)作为先天性免疫抵御病原菌入侵的重要防线，其通过脱颗粒作用、活性氧(ROS)的产生、吞噬功能以及中性粒细胞胞外陷阱的形成抵抗病原菌的感染，此外还可以产生各种细胞因子和趋化因子，通过募集和激活免疫系统的其他效应细胞为先天免疫和适应性免疫之间提供至关重要的联系[50]。Nerren等[51]在体外用马红球菌的强毒株和无毒株刺激成年马的中性粒细胞，通过对成年马中性粒细胞的细胞因子表达谱进行评价，与未处理组相比，成年马中性粒细胞中TNF-α、IL-12p40、IL-6、IL-8和IL-23p19的mRNA的表达显著上调，而IFN-γ和IL-12p35则下调；与无毒株相比，强毒株可以诱导更高的IL-23p19的mRNA表达。马红球菌感染后，中性粒细胞细胞因子表达谱的变化说明了中性粒细胞的细胞因子可能也会影响宿主对马红球菌的清除。

马驹的中性粒细胞功能存在免疫缺陷，主要表现在杀菌能力和血清调理能力的降低[52-53]；同时，马驹的中性粒细胞中细胞因子的表达呈年龄依赖性变化，这也反映了马驹中性粒细胞的杀菌能力和血清调理能力的下降[54]。胞嘧啶-磷酸-鸟苷寡脱氧核苷酸(Cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotides，CpG-ODNs)作为一种免疫刺激DNA，在体外实验中可以激活马驹中性粒细胞的细胞因子表达和活性氧(ROS)的产生[55]。此外，Bordin等[56]发现TLR9的激动剂CpG2142也可以促进马驹中性粒细胞的脱颗粒并且诱导IL-6和IL-17mRNA的表达，从而增强中性粒细胞的免疫功能。因此，虽然马驹的中性粒细胞功能缺陷，但通过免疫刺激剂可以提高中性粒细胞的免疫功能，这可能有助于马驹抵御马红球菌的感染。

3 马红球菌与适应性免疫

适应性免疫是指机体免疫系统在抗原的刺激下，产生一系列的免疫反应，包括抗原的识别、加工与递呈、T、B淋巴细胞的活化、细胞因子、抗体及效应T细胞的产生，以及抗原被清除等过程[57]。马红球菌侵入后，T淋巴细胞所介导的细胞免疫应答和B淋巴细胞所介导的体液免疫应答在宿主抗感染过程中发挥着重要作用[58]。

3.1 马红球菌与T淋巴细胞的相互作用

T淋巴细胞是适应性免疫的重要组成部分，其识别MHC-抗原复合物后被活化、增殖、分化为效应T 淋巴细胞(主要是CD4+T 和CD8+T)，并杀伤靶细胞[59]。目前在小鼠和成年马中证明了CD4+T细胞和CD8+T细胞产生的IFN-γ可以将马红球菌清除；同时，将成年马特异性免疫的CD4+T细胞过继转移到T淋巴细胞免疫缺陷的小鼠中，可以保护小鼠免遭马红球菌的侵袭[60-62]。除直接杀伤靶细胞之外，不同Th细胞亚群产生的细胞因子在适应性免疫反应中也起着重要作用。在成年马中，以IFN-γ产生为特征的Th1反应可以将马红球菌完全清除；同时，活化的巨噬细胞和树突状细胞产生的IL-12也会刺激Th0细胞分化为Th1细胞，从而对马红球菌进行清除[63]。在马驹细胞免疫的过程中，低剂量的马红球菌强毒株会使马驹对马红球菌产生较强的Th1免疫反应，然而最后所有马驹都发展为肺部病变。尽管出现了明显的Th1反应，但其机体免疫的详细机制仍需探索[64]。Wagber等[65]用佛波脂12-肉豆蔻13-乙酸酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate)刺激成年马和马驹的外周血单个核细胞，通过流式细胞术对细胞因子进行检测的结果显示，马驹CD4+和CD8+T细胞产生IFN-γ的量与成年马相似，但IL-4的表达量较低，表明马驹的免疫应答偏向于Th1型，Th2型细胞反应受损。成年马体液免疫主要依赖于Th2型细胞反应的B细胞活化，但是马驹中Th2型反应受损可能会导致马驹的体液免疫受损[66]。

3.2 马红球菌与B淋巴细胞的相互作用

B淋巴细胞作为宿主体液免疫中重要的效应细胞，可以通过B细胞抗原受体(B-Cell Receptor，BCR)识别抗原、活化、增殖并分化为浆细胞，利用分泌的特异性抗体(免疫球蛋白)对病原菌进行有效清除。马免疫球蛋白包含IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。IgG占总血清Ig的80%，是介导体液免疫的主要抗体，其含量高、分布广，具有较强的抗感染、中和毒素和免疫调理作用。IgGa和IgGb作为成年马血清和初乳中最丰富的IgG亚类，对于机体免疫均很重要，因为这两个亚类均介导补体系统和抗体依赖性细胞毒性的激活[67-68]。然而马驹在12周龄到8个月之间，IgGb的内源性合成延迟，其水平显著低于IgGa，这可能是马驹体液免疫不能有效消除马红球菌的原因之一[69]。IgE在初乳摄取后不久便可以在马驹血清和白细胞中检测到，但生长至2～3个月时，随着母体IgE的摄入与马驹内源性合成的下降，不能检测到IgE或IgE阳性细胞[70]。黏膜IgA作为呼吸道的一道防御，马驹刚出生的28 d内，其鼻黏膜表面不存在IgA也可能会导致马驹对马红球菌易感[69]，可以通过增强黏膜IgA保护马驹免受气管及支气管中马红球菌的感染。

在抗体介导的体液免疫中，使用高免疫血浆或注射VapA的多肽疫苗增加宿主对马红球菌的免疫能力[71]。Cywes-Bentley等[72]利用马红球菌表面的多聚糖与N-乙酰氨基葡萄糖(Poly-N-acetyl glucosamine，PNAG)的结合疫苗，在分娩前6周和3周接种怀孕母马，使马驹通过初乳摄取母源抗体。结果显示，接种疫苗母马所生的12匹马驹中有11匹没有表现马红球菌肺炎的临床特征，而未接种疫苗的对照组所生的7匹马驹中，有6匹最终发展为马红球菌肺炎；此外，直接注射PNAG-高免疫血浆的马驹可100%保护其免受马红球菌的侵袭，并在马驹外周血单个核细胞中检测到更高水平的IFN-γ。这些实验表明，虽然B细胞介导的体液免疫存在一定的功能缺陷，但也可以降低马红球菌对马驹的伤害程度。

4 展 望

宿主感染马红球菌的免疫机制中，马驹因其免疫细胞功能缺陷成为易感宿主，主要表现为树突状细胞的表面分子MHC-II、CD14+、CD1w2+及CD86+的表达量较低，导致树突状细胞的抗原呈递能力下降；中性粒细胞杀菌能力和血清调理能力较低；细胞因子IFN-γ、TGF-β、IL-1α、IL-4、和IL-12的表达量低于成年马等。但目前对马驹的免疫系统、细胞因子及抗原提呈细胞在抗感染中所起的作用并不完全了解，例如：树突状细胞对T淋巴细胞分化增殖的影响和机制以及中性粒细胞是怎样在先天免疫和适应性免疫之间发挥作用都无具体报道。因此，更加深入了解马驹的免疫系统、细胞因子及抗原提呈细胞对于马红球菌致病机制及疫苗的研发会有很大帮助。在马红球菌与巨噬细胞相互作用中，其通过抑制吞噬体/自噬体与溶酶体融合，形成pH呈中性的环境，从而促进马红球菌在巨噬细胞内的生长。自噬作为真核细胞中保守的降解途径,其通过自噬前体的形成、自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合以及自噬溶酶体的降解这四个步骤对侵入性病原体进行降解，在细胞的生存、抗感染免疫等方面起着重要作用。因此，探索马红球菌与巨噬细胞自噬的关系有助于进一步了解该病原菌的致病机制。在马驹的免疫的过程中，出现了较强的Th1型免疫反应，但最后马驹均发展为肺部病变，这可能是因为马驹的Th2型反应受损以及其IgGb、IgE和IgA水平较低。从马红球菌诱导宿主的免疫应答特点可以看出，理想的疫苗不仅要平衡Th1/Th2 免疫应答，还要诱导宿主产生高亲和力的抗体，因此合适的抗原蛋白以及平衡Th1/Th2 免疫应答的免疫佐剂的选择至关重要。综上，继续对宿主感染马红球菌的免疫机制进行探索对于疫苗的开发利用和病原菌的防治都有着重要意义。