基于网络药理学的墨旱莲-女贞子药对“异病同治”糖尿病肾病与糖尿病视网膜病变的机制研究*

王娟 ，韩旭 ，李立 ，韩森 ，赵宁 ，崔赵丽 ，丁治国 ，王光磊 ，姜淼 ，顾浩

（1.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700；2.潍坊市中医院科教部，潍坊 262699；3.北京中医药大学东直门医院东区内分泌科，北京 101100；4.北京中医药大学东直门医院东区外科，北京 101100；5.北京中医药大学东直门医院体检中心，北京 100700）

糖尿病是一种多因素导致的糖代谢异常疾病，2019年全球糖尿病患病率为9.3%，预计2030年将上升到10.2%[1]，糖尿病肾病（DN）与糖尿病视网膜病变（DR）是临床常见糖尿病微血管并发症，是血糖异常导致的肾脏病变与眼底病变。对于糖尿病患者来说，DN发病率能达到30%～40%[2]，DR患病率约为23%[3]，两者分别是末期肾病和成人致盲的主要原因。

DN是由糖脂代谢障碍、氧化应激失衡、炎症因子失调和血液微循环失调等原因导致的肾小球病变[4]，DR是由高血糖、炎症反应、氧化应激反应和神经保护因子等因素引起的视力逐渐减退，最终导致失明[5]。理论上，DN与DR都属于糖尿病微血管并发症，两者可能有共同的发病机制，如高糖毒性、自由基作用、多元醇代谢异常、炎症介质氧化应激及遗传因素等[6]，并且有研究表明，眼底检查可提示糖尿病患者的肾脏病变[7]。传统中医理论认为，肝肾同源，肾为肝之体，肝为肾之用，肾的疾病往往离不开肝的失调，同时，肝开窍于目，五脏六腑之精皆上注于目，故肝与目在生理病理上密切相关，并且目的生理正常离不开肾精的调养，这就提示了DN与DR之间的密切联系，两者之间的发生与治疗可能存在相通的地方。目前DN与DR主要采用药物治疗和手术治疗，但是其存在药物抵抗和术后并发症等不良反应。西医疗法联合中药治疗DN与DR在临床上很常见，但是大部分以单方剂为主，很少使用复方作为主要治疗药物，主要原因就是中药的有效成分和药理作用机制尚不明确。

国医大师吕仁和教授在临床治疗DN与DR时，常配伍墨旱莲-女贞子对药，以滋补肝肾，明目凉血，治疗肝肾阴虚所导致的DN与DR等糖尿病并发症，补阴以制阳亢[8]。墨旱莲记载于《新修本草》，能够滋补肝肾，凉血止血；女贞子首载于《神农本草经》，主要功效是滋补肝肾，明目乌发，两药均具有抗炎、抗氧化、免疫调节、治疗糖尿病等药理作用[9-10]。但是这一药对治疗DN、DR的具体作用机制尚不明确，因而限制了其在临床实践中的推广应用。

网络药理学是基于系统生物学和多向药理学的角度，对药物治疗疾病的作用成分、作用靶点和作用通路进行解析，构建整体网络模型，从多角度深入探讨药物治疗疾病的药理作用机制，并且现在已经有许多研究证明了网络药理学方法对探索中药治疗疾病作用机制的可靠性和准确性。Guo等[11]利用网络药理学研究了左金丸治疗肝癌的作用机制，并且验证了左金丸通过PI3K-NF-κB、EGFR-MAPK和CCND1通路对肝癌细胞的抑制作用。马林等[12]通过构建成分-靶点-通路网络模型，预测了丹七片治疗冠心病可能是通过丝氨酶/基氨酸/蛋白激酶（AKT1）、白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK1）等关键靶点。利用网络药理学从成分、靶点、通路、生物过程等方面整体分析探索墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的作用机制，符合中医理论的整体作用特点，也为中药复方制剂的机制研究提供一种新思路新方法。

传统中医理论认为“异病同治”指不同的疾病在发生发展过程中出现了相同病机，故而可以采用同样的方法加以治疗，墨旱莲-女贞子药对滋补肝肾以治疗DN与DR符合“异病同治”的理念。本文利用网络药理学的方法，探索墨旱莲-女贞子药对的有效成分、关键作用靶点和通路，以明确其作用机制，为中药复方治疗DN与DR的药理作用研究提供参考，以期进一步推进中医药治疗糖尿病慢性并发症的临床应用。

1 资料和方法

1.1 墨旱莲-女贞子药对化学成分的搜集与筛选 通过中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和中药化学成分数据库（TCMID，http：//119.3.41.228：8000/tcmid/）搜索关键词“墨旱莲”和“女贞子”，得到药物所含活性成分相关信息，筛选符合条件的化合物作为药物有效成分，本研究筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%，脂水分配系数（Alogp）＜5，氢键供体数（Hdon）＜5，氢键受体数（Hacc）＜10，肠上皮通透性（Caco-2）＞0，类药性（DL）≥0.1，药物半衰期（HL）≥4[13]。

1.2 墨旱莲-女贞子药对靶点的筛选 将筛选得到的药对有效成分逐一输入TCMSP数据库，得到每个成分对应作用靶点，再利用蛋白质数据库（Uniprot，https：//www.uniprot.org/）的 UniProtKB 功能，逐一录入靶点并将物种限定为人，将所有靶点校正为官方名称（official symbol），即为墨旱莲-女贞子药对的作用靶点。

1.3 DN与DR的靶点筛选 利用GeneCards数据库（http：//www.genecards.org/）、NCBI-gene 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）和人类孟德尔遗传数据库 OMIM（http：//www.omim.org/）3 种数据库，输入关键词“Diabetic Nephropathy”“Diabetic Retinopathy”查找筛选疾病相关的靶点。

1.4 靶点蛋白相互作用网络构建 将药对作用靶点输入 String数据库（https：//string-db.org/），置信度设置为0.9，得到药对靶点蛋白相互作用（PPI）网络模型，将数据导出，输入Cytoscape3.7.2软件，进行可视化，并利用MCODE Cluster算法[14]，按照默认参数（Node Score Cutoff：0.2，Haircut：true，Fluff：false，K-Core：2，Max.Depth from Seed：100）对网络进行模块划分。

1.5 作用靶点与组织分布网络构建 将共同靶点输入 BioGPS（http：//biogps.org/#goto=welcome）数据库，以大于等于中位数的基因表达量为界限筛选出每个靶点基因分布的器官/组织，整理胰岛（Pancreatic Islet）、视网膜（Retina）和肾脏（Kidney）中的表达基因，利用Cytoscape3.7.2软件构建作用靶点-组织分布网络图。

1.6 基因功能和通路富集分析 通过TBtools软件（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools） 获取墨旱莲-女贞子药对、DN、DR的共同靶点，将共同靶点输入基因功能资源数据库（THE GENE ONTOLOGY RESOURCE，GO，http：//geneontology.org/） 进行基因功能富集分析，将分析得到的相关性前12个结果通过柱状图展示。

将共同靶点输入Cytoscape3.7.2软件插件ClueGO[15]中，计算富集结果的每个P值，并通过Bonferroni方法校正，以P＜0.05为筛选条件，根据从小到大的顺序对P值进行排序。

2 结果

2.1 墨旱莲和女贞子的有效作用成分 在TCMSP数据库中，根据筛选条件筛选得到符合要求的活性成分，墨旱莲有10种，女贞子有5种，详细信息见表1。

表1 墨旱莲与女贞子的活性成分信息表

2.2 构建墨旱莲-女贞子药对治疗DN与DR的靶点网络模型 通过整理得到墨旱莲的作用靶点88个，女贞子的作用靶点111个，去重后得到墨旱莲-女贞子药对的潜在作用靶点124个，DN相关靶点2 614个，DR相关靶点2 587个。其中墨旱莲-女贞子药对与DN直接相关的靶点88个，与DR直接相关的靶点69个，韦恩分析图见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。利用String数据库和Cytoscape3.7.2软件构建的墨旱莲-女贞子靶点相互作用关系网络见OSID，节点连接度排名前20位的靶点连接靶点数目见OSID，RXRA与 DN、DR的治疗不直接相关，CDK1、CDKN1A、RB1、CASP8只与 DN 的治疗直接相关，CCNA2与DR的治疗直接相关，其他14个靶点，包括 TP53、AKT1、TNF、RELA、VEGFA、MAPK1/8/14等都与DN和DR的治疗直接相关，很有可能是墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的关键靶点。

2.3 基于网络模块化分析墨旱莲-女贞子药对治疗DN与DR的靶点 利用MCODE网络模块划分方法，对墨旱莲-女贞子的靶点网络降维分解以便更清晰明了地观察和分析网络，最后得到8个核心模块，结果见OSID。其中有7个模块与DN、DR都相关，模块6中没有与DN或者DR直接相关靶点。同时，结果显示墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的靶点主要分布在模块1、2、3中，对这3个模块中的药对、DN、DR的共同靶点进行KEGG通路和生物过程（BP）富集分析，得到的结果见表2。

表2 核心模块中“异病同治”靶点的KEGG通路和BP富集分析

2.4 基于靶点-组织分布分析墨旱莲-女贞子的DN与DR作用机制 利用BioGPS数据库和Cytoscape3.7.2软件构建墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的作用靶点-组织分布网络图，见图1。图中共有66个节点，130条边，其中边的粗细代表了靶点在组织中的表达量大小，从图中可以看出，APP、VEGFA、GSTP1、INSR、VCAM、ACHE 和 SELE 等 11个作用靶点均在胰岛、视网膜和肾脏组织中高表达，其具体信息见图2。

图2 3个组织中同时高表达的作用靶点的相关信息柱状图

2.5 墨旱莲-女贞子药对作用于DN、DR靶点的GO分析 对墨旱莲-女贞子药对作用于DN与DR取交集，得到墨旱莲-女贞子既直接作用于DN又直接作用于DR的靶点有63个，对这63个靶点进行GO分析，发现1 686个BP、68种细胞成分（CC）和136个分子功能（MF）可能与墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的机制相关。其中富集得到的前15个GO分析结果具体信息见图3。

图3 墨旱莲-女贞子药对作用于DN、DR靶点的GO分析结果

图1 作用靶点-组织分布网络图

2.6 墨旱莲-女贞子药对治疗DN与DR的KEGG通路分析 通过ClueGo对墨旱莲-女贞子药对既直接作用于DN又直接作用于DR的63个靶点进行KEGG通路富集分析，得到115条通路（P＞0.05），提取P值最小的前20条通路进行可视化分析，见图4，其中前10条通路详细信息见表3。

表3 前10条KEGG通路信息

图4 墨旱莲-女贞子药对治疗DN与DR的KEGG通路分析

3 讨论

3.1 墨旱莲-女贞子药对治疗DN与DR的有效成分分析 墨旱莲-女贞子药对治疗DN与DR包含木犀草素、金合欢素和山奈酚等14种有效成分，其中木犀草素是墨旱莲与女贞子的共同作用成分，而且关联了 AKT1、INSR、MAPK1、TNF、VEGFA 等关键靶点，表明木犀草素可能是墨旱莲-女贞子药对发挥协同作用的主要成分，研究发现，木犀草素能够通过降低TLR4与JNKmRNA的水平以改善2型糖尿病大鼠胰岛素的抵抗作用，可能通过增加超氧化物歧化酶（SOD）含量，激活Nrf2/HO-1通路而延缓糖尿病大鼠视网膜病变过程，而且能够明显减轻糖尿病引起的血管并发症[16-18]。此外，墨旱莲的有效成分金合欢素也能改善DN与DR患者的炎症反应和细胞凋亡[19-20]，女贞子的有效成分山奈酚能够通过一定途径控制糖尿病患者的血糖水平[21-23]。

3.2 基于KEGG富集与GO富集分析墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的机制 从药对的靶点-组织分布网络和靶点蛋白PPI网络可以看出，VEGFA、GSTP1、INSR、TNF、AKT1、VCAM1、IL-6 和MAPK1等靶点可能是墨旱莲－女贞子“异病同治”DN与DR的关键靶点，而且这些重要靶点大部分在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路和HIF-1信号通路中都可富集到。糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路是DN与DR发生发展过程中的重要一环，能够激活核转录因子－κB（NF－κB），刺激血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）的产生，诱导单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达[24]，从而促使肾小球硬化、肾纤维化、炎症反应发生、血栓形成和视网膜心血管生成。TNF-α是TNF信号通路中的核心基因，抑制NF-κB/TNF-α信号通路的活化，可以减少促炎因子TNF-α、IL-1β的表达，进而对肾脏起到保护作用[25]，改善DN与DR患者的炎症反应和视网膜内皮细胞凋亡。IL-17信号通路介导了炎症反应和相关的肾组织损伤与肾小球硬化[26]，抑制IL-17信号通路能够缓解DN、DR的炎症反应和肾脏损伤。PI3K-Akt信号通路参与了高糖诱导的视网膜神经细胞凋亡过程[27]，通过PI3K-AKT/mTOR信号通路上调自噬，能够减轻氧化低密度脂蛋白胆固醇（ox-LDL）诱导内皮细胞的氧化应激损伤[28]。抑制HIF-1信号通路可以降低增殖性DR的病理性视网膜血管生成[29]，改善糖尿病状态下肾脏肾小管上皮细胞间充质转分化及肾小管间质纤维化[30]，从而改善DN、DR。

墨旱莲-女贞子药对直接作用于DN和DR的63个共同靶点的GO分析结果表明，墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的靶点主要集中在膜区、细胞质核周区域、膜封闭腔和胞质溶胶等细胞成分，同时影响酶结合、蛋白质结合、信号受体结合和BH3域结合等分子功能，并参与了对含氧化合物的反应、细胞对化学刺激的反应、对脂质的反应和细胞群增殖的调节等生物过程，进而对机体的氧化应激、炎症反应、糖脂代谢等过程进行调节，以影响DN与DR的病理进程。

3.3 墨旱莲-女贞子治疗DN与DR的核心模块分析与潜在作用靶点发现 生物网络的聚类模块分析是识别功能模块和预测蛋白质功能的重要方法之一，聚类结果的可视化对于揭示生物网络的结构至关重要。在对模块分析结果中的3个核心模块进行KEGG通路和生物过程富集分析发现，这些核心模块中与DN、DR直接相关的靶点主要涉及肿瘤、免疫和细胞因子传导相关通路，参与细胞应激反应、增殖和活化等生物过程，进一步验证了墨旱莲-女贞子药对治疗DN与DR作用靶点对免疫系统和细胞增殖与凋亡的影响。此外，GSK3β与MAPK8、JUN、AR在同一功能模块5中，而MAPK8、JUN、AR与DN、DR的病理机制直接相关，这表明GSK3β与DN、DR的病理作用是可能存在间接联系的，而且通过查阅文献发现，GSK3β是NF-κB介导的对TNF-α的抗凋亡反应所必须的[31]，调控NF-κB信号通路和TNF-α表达能够影响肾小球系膜的氧化应激反应和肾纤维化[32-33]，从而影响DN、DR的病理进程。XIAP与CASP7、CASP9在同一功能模块7中，CYP1A1与CYP1B1、AHR在同一功能模块9中，但是数据显示XIAP、CYP1A1与DN直接相关而不与DR直接相关。查阅文献发现，XIAP能够调节BMP信号通路以及SMAD和MAP3K7/TAK1依赖性通路[34]，从而导致NF-κB和JNK活化，抑制JNK信号通路能够减少细胞凋亡，改善DR[35]；CYP1A1参与NADPH依赖性电子转运途径，NADPH减少能够导致还原性谷胱甘肽生成减少，从而降低细胞的抗氧化能力，加速细胞坏死[36]，这可能与DR的发生密切相关。这些研究表明，GSK3β、XIAP和 CYP1A1可能是墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的潜在作用靶点，具有一定的研究价值，对后续新药研发和临床研究具有一定的启示作用。

3.4 利用网络药理学对“异病同治”理论的研究优势 中医“异病同治”理论是对疾病的病机和症状进行归纳总结并且在临床实践中得到了验证，但是由于现代临床状况和社会因素的影响，“异病同治”理论的病理发生机制和治疗机制均未得到充分的研究，这就限制了“异病同治”方法在临床中的应用，并且可能会错过某些疾病的良好治疗方法。网络药理学是大数据时代利用计算机技术构建跨越药物、分子、细胞、组织、器官、患者和疾病种类之间的整体网络，实现对靶标、通路、生物过程的筛选和临床研究前的预测和验证，能够节省大量的科研资源与经费，直接得到最关键的研究思路与研究方向。

在本研究中，利用网络药理学对墨旱莲-女贞子药对对DN与DR的“异病同治”作用进行研究，探索了DN与DR两种疾病的共同靶点、共同通路和涉及的生物过程、分子功能及细胞成分，从多方面验证了“异病同治”理论的科学性，如共同关键靶点VEGFA、AKT1、TNF和VCTM1等，这些靶点已经被证实在DN与DR的病理过程中起到重要作用：VEGFA水平下降可能导致HIF1A升高，进而导致DN肾纤维化，使肾小球滤过率下降[37]，而且调节VEGFA能够抑制新血管生成和血管通透性增加进而缓解DR进程[29]；降低TNF-α的表达水平，能够抑制DN患者的微炎症反应，改善肾功能[38]，调节TNF表达能够降低DR患者视网膜血管通透性增高和血管内皮细胞增殖[39]。而且这些关键靶点在肾脏、视网膜和胰岛中都有高表达，富集得到的相关通路也对DN、DR的治疗意义重大。这些网络药理学分析结果都从多方面验证了“异病同治”方法在临床应用中的准确性和可靠性，两种不同的疾病在分子水平、细胞水平和组织器官水平的关联都得到了解析，由此可见“异病同治”理论的科学性以及这种方法广泛应用于临床的可行性。

3.5 前景与展望 本研究利用网络药理学的方法探索墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的作用机制，意在从药物成分、靶点和通路层面研究中药药对的药理作用原理，但是中药在炮制及煎煮过程中可能会产生新的成分，而且机体的生理状态与病理状态下的中药吸收、分布、代谢、排泄（ADME）过程可能会有所不同，可能会影响药物的作用途径。而且，对于个体化的治疗数据以及数据的定量化分析，对疾病的治疗具有重要意义，这就有待实验研究和临床研究中相关数据的补充，为中药的网络药理学研究提供更全面和科学的数据平台。

4 结论

综上所述，墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR可能通过木犀草素、金合欢素和山奈酚等21种有效成分，作用于 VEGFA、INSR、IL-6、AKT1、VACM1等关键靶点，进而调节糖尿病并发症中的AGERAGE信号通路、TNF信号通路和IL-17信号通路等，调节机体的氧化应激、炎症反应和糖脂代谢过程等生物反应过程，以达到对DN和DR“异病同治”的治疗作用。同时，GSK3B、XIAP和CYP1A1可能是墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的潜在作用靶点，为临床新药的研发提供了一定思路。

利用网络药理学的方法，对墨旱莲-女贞子药对“异病同治”DN与DR的作用机制进行了研究，结果表明不论从作用靶点还是相关通路方面，墨旱莲-女贞子药对治疗DN和DR的作用机制都十分相似，这也从网络药理学的角度进一步印证了“异病同治”这一中医理论的科学性，验证了吕仁和教授的临床经验，为中药的临床应用与开发提供了一定的研究方向。