心脑宁胶囊通过调节NF-κB介导的抑炎通路保护脑缺血再灌注损伤的作用及机制研究*

任杰 ，王钰乐 ，贺爽 ，李志雄 ，朱彦

（1.天津中医药大学组分中药国家重点实验室，天津 301617；2.天津国际生物医药联合研究院中药新药研发中心，天津 300457）

缺血性卒中是引起死亡、长期残疾以及认知功能障碍的主要原因之一[1]。血管复通作为缺血性卒中治疗的重要环节，引起的组织缺血再灌注损伤仍然是亟待解决的难题。脑缺血再灌注损伤（CI/RI）涉及的机制主要包括自由基损伤、兴奋性氨基酸毒性、钙离子超载、炎性反应和细胞凋亡[2]。现代药理学研究显示，中药多成分的特点对改善CI/RI有显著优势[3-4]。心脑宁胶囊临床上对心血管疾病具有良好疗效，但在脑血管疾病领域的研究较少，分子机制研究几乎是一片空白[5]。本实验旨在明确心脑宁胶囊对CI/RI的保护作用，并进一步探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康ICR小鼠，雄性，体质量20～23 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2016-0011。动物实验方案经天津中医药大学动物伦理委员会批准，许可证编号：TCM-LAEC2014004

1.1.2 药物与试剂 心脑宁胶囊（贵州景诚制药有限公司，国药准字Z20025679），依达拉奉注射液（南京先声东元制药有限公司，国药准字H20031342），碘海醇注射液（通用电气药业有限公司，国药准字H20000591）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染料（T8170，北京索莱宝科技有限公司），苏木精-伊红（HE）染料（天津泰艾瑞科技有限公司）；RIPA组织/细胞裂解液（R0010，北京索莱宝科技有限公司），SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（P0015L，上海碧云天生物技术有限公司），二辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒（PC0020，北京全式金生物技术有限公司）；一抗兔抗鼠核转录因子-κB（NF-κB）p65（ab16502，英国Abcam公司），辣根酶标记山羊抗兔IgG（ZB-2301）和 β-actin抗体（8457S）（北京中杉金桥生物技术有限公司），Super Signal®West Pico化学发光底物（NCI5079，美国Thermo公司）。

1.1.3 主要仪器 异氟烷麻醉系统（美国MIDMARK公司），Micro-CT（美国 PerkinElmer公司），病理切片机（德国Leica公司），Eppendorf AG 5424离心机（德国艾本德股份公司）。

1.2 动物分组与给药 雄性ICR小鼠适应性喂养2～3 d，将实验小鼠随机分为4组，分别为假手术组、模型组、心脑宁胶囊组[3 g/（kg·d），灌胃]、依达拉奉组[9 mg（kg·d），注射]。模型组和假手术组灌胃生理盐水。所有小鼠均预处理7 d，最后1天给药1 h后，进行相应的手术操作。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠脑缺血再灌注模型的建立 沿用Koizumi的大脑中动脉阻塞（MCAO）实验方法[6]。小鼠持续通入2%异氟烷麻醉，仰卧位固定于显微镜下。颈部手术部位备皮，沿颈部正中剪开皮肤，长度约10 mm。分离小鼠左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，用4-0医用缝线结扎颈总动脉近心端，远心端剪口并插入MCAO线栓（L1800，广州佳灵公司）以阻断大脑中动脉血流。用蘸有生理盐水的棉花覆盖手术伤口，维持麻醉并计时30 min。缺血结束之后，在镜下将线栓取出，双结扎颈总动脉避免出血，缝合皮肤。将动物置于温度适宜的环境中，给与容易获得的食物和水。假手术组的小鼠在分离了颈总动脉之后，同样双结扎颈总动脉，随即缝合，不进行线栓缺血手术操作。

1.3.2 神经行为学评价 分别在手术完成苏醒后（0 h）及缺血再灌注24 h时参照Longa评分法[7]，对小鼠进行神经功能评分。无神经损伤症状，与正常小鼠无异计为0分；提尾后不能完全伸展对侧前爪计为1分；将动物放置平板上，向造模侧转圈计为2分；行走时，向一侧倾倒，难以翻正计为3分；不能自发行走，意识丧失计为4分。评分1～3分可初步认定模型建立成功，并记录入组。行为学评分采用盲法，即评分者不了解动物分组情况。

1.3.3 脑水肿的测定 缺血再灌注24 h时，小鼠采用4%水合氯醛麻醉。设定Micro-CT运行参数：电压90 kV，电流180 mA，视场角FOV 20 mm。在显微镜下，再次暴露颈总动脉。用1 mL胰岛素注射器吸取0.5 mL碘海醇注射液，从原线栓入口注入。选择“CT scan”扫描4.5 min，得到初步影像数据之后，对目标平面逐一重建和调整，测量中线偏移距离。以（缺血侧距离-正常侧距离）/2作为中线偏移距离[8]。

1.3.4 脑梗死面积测定 在完成水肿的测定后，断头取脑，剔去颅骨，取出完整脑组织，置于准备好的pH=7.4的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中。取出嗅球、小脑、及脑干，再将大脑置于小鼠脑切片模具中，按照2 mm的厚度进行分离，共计5片，不同小鼠之间每片大小位置尽可能一致。将脑组织切片置于1%TTC的PBS溶液中，37℃避光15 min，其中每隔3～4 min翻面1次。正常脑组织染为红色，梗死区脑组织为苍白色。染色后将脑切片按照原始顺序摆放并照相，采用Image J图像分析系统计算梗死区域面积，并计算梗死百分比。脑梗死百分比=（白色梗死面积/脑切片总面积）×100%。

1.3.5 脑组织病理学检查 缺血再灌注24 h，用4%水合氯醛麻醉动物，剪开胸腔，进行心脏灌流，从左心室快速灌注生理盐水100 mL，后用4%多聚甲醛200 mL灌注固定，于20 min灌注完毕。然后迅速取出大脑置于4%多聚甲醛中固定48 h以上。每个组织块均经酒精梯度脱水、石蜡包埋后，进行石蜡切片及HE染色，切片厚度为4 μm。光镜下观察纹状体区组织学变化。

1.3.6 数据库的建立与分析 1）疾病-靶点数据库，以“Cerebral ischemia/reperfusion injury”为关键词，通过Ingenuity® Pathway Analysis（IPA）、NCBI（gene）等数据库获得疾病相关靶点。2）整合TCMSP数据库中关于银杏叶、丹参、薤白、大果木姜子、小叶黄杨的化学成分，通过PubMed中相关综述及成分鉴定文献进行相应补充，建立心脑宁胶囊的化学成分库。3）通过建立的化学成分库，与IPA靶点数据库进行合并分析，建立成分靶点关系。使用“Overlay-Canoical Pathway”及“Core Analysis”模块进行分析，寻找成分调控疾病的TOP通路。利用“Core Analysis-Upstream Analysis”开展上游调控因子分析，通过整合上游调控因子与该通路相关靶点，得到一系列关键靶点，最后利用“Build-Connection”分析靶点之间的交互网络，寻找其中的核心靶点。

1.3.7 蛋白免疫印迹（Western Blot）测定 将脑组织放入预冷的RIPA裂解液中，用超声粉碎机破碎，4℃离心，离心半径为84 mm，12 000 r/min共10 min，吸取上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度，定量。加入SDS-PAGE蛋白质上样缓冲液并在95℃的金属浴中加热变性。电泳分离蛋白质样品后转印到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭，滴加一抗（NF-κB p65，1∶2 000；β-actin，1∶4 000）后在 4 ℃冰箱孵育过夜。TBST洗净一抗后滴加二抗山羊抗兔IgG（1∶4 000），室温孵育2 h。使用增强的化学发光检测试剂进行印迹检测。最后使用Image J软件量化蛋白条带的灰度强度，并与每个样品中的β-actin进行归一化。

1.3.8 免疫组织化学染色 将脑切片脱蜡水洗，避光孵育过氧化氢（H2O2），磷酸缓冲盐溶液（PBS）水洗后进行微波抗原修复，修复完成水洗后血清封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，经过二抗37℃孵育后PBS漂洗。加入DAB显色，苏木素复染后盐酸酒精分化几秒进行水洗，梯度脱水后封片。在显微镜下观察，根据免疫反应产生棕色颗粒的数量及分布，对阳性表达进行定性定量分析。

1.4 数据纳入标准与统计学方法 经过造模的小鼠，初次行为学评分在合理范围内，24 h内无死亡，以及Micro-CT测定无明显蛛网膜下腔出血情况，方可纳入该组数据，若样本数不足，则再次重复上述实验过程。实验最终数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 22.0进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。用GraphPad Prism8.0软件对实验数据作图。

2 结果

2.1 对小鼠神经行为学评分的影响 在0 h时，模型组与假手术组比较，评分显著提高（P＜0.001），提示模型建立成功。24 h时，心脑宁胶囊组与依达拉奉组评分较模型组有所下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表 1。

表1 各组小鼠神经功能评分（±s） 分

表1 各组小鼠神经功能评分（±s） 分

注：与假手术组比较，*P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.01。

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2.2 对小鼠脑水肿的影响 假手术组中线居中分布，未见明显偏移；模型组中线偏移（0.99±0.14）mm，提示造模产生了严重的组织水肿；心脑宁胶囊组与依达拉奉组偏移距离小于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表 2及图 1。

表2 各组脑中线偏移距离（±s）mm

表2 各组脑中线偏移距离（±s）mm

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

组别 动物数 中线偏移距离假手术组 6 0.0 7±0.0 3模型组 6 0.9 9±0.1 4*心脑宁胶囊组 6 0.4 7±0.0 6#依达拉奉组 6 0.4 4±0.2 0#

图1 各组小鼠脑中线偏移Micro-CT成像

2.3 对小鼠脑梗死面积的影响 假手术组组织完整，未见白色梗死区域，提示未造成缺血损伤；模型组灰白区几乎覆盖整个半脑，存在严重的脑梗死；与模型组相比，心脑宁胶囊梗死面积显著减少（P＜0.01），依达拉奉组梗死面积更小（P＜0.001）。见表 3及图2。

表3 各组小鼠梗死面积（±s）%

表3 各组小鼠梗死面积（±s）%

注：与假手术组比较，*P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.01，##P＜0.001。

组别 动物数 梗死面积假手术组 6 0模型组 6 4 5.0 2±3.4 4*心脑宁胶囊组 6 3 1.3 2±4.4 0#依达拉奉组 6 1 9.8 4±5.7 5##

图2 各组小鼠脑切片TTC染色结果

2.4 对小鼠组织病理学影响 假手术组：细胞排列紧密，形态正常，胞质色淡且均匀，胞核大小正常，染色较深。模型组：细胞空泡化现象严重，细胞膜断裂，细胞器丢失，细胞核固缩、碎裂，呈现明显的坏死性病变。心脑宁胶囊组：损伤程度介于模型组与假手术组之间，有一定的胞核固缩深染现象，存在少量的间质水肿，细胞排列较为杂乱。依达拉奉组：仍然存在一定的核固缩状况，但较模型组及心脑宁胶囊组有所改观，提示其损伤程度最为轻微。见图3。

图3 各组小鼠脑组织病理情况（HE，×200，n=5）

2.5 网络药理学分析 如图4A所示，“Overlay-Canonical Pathway”功能模块分析结果显示，根据-lg（P value）值大小对心脑宁胶囊调控CI/RI疾病靶点最相关的前20条经典通路排序，其中位列第1位的是神经炎症信号通路（Neuroinflammation signaling pathway），表明神经炎症信号通路可能是心脑宁胶囊发挥脑保护作用潜在机制之一。通过上游调控因子分析模块获得排名靠前的上游调控因子，如图4B所示，中间区域为前20位的上游调控因子。利用“Overlay-Canonical Pathway”模块筛选出57个神经炎症信号通路相关靶点，如图4C所示。通过整合神经炎症信号通路靶点与上游调控因子相关靶点，交集显示存在10个共同靶点，核心靶点互作分析显示，转录调控因子 RELA（NF-κB p65）处于关键位置，如图4D。采用网络药理学分析与实验验证相结合的研究思路，对转录调控因子NF-κB相关蛋白的表达进行实验验证。

图4“心脑宁胶囊-脑缺血再灌注损伤”核心靶点分析示意图

2.6 对NF-κB p65蛋白表达水平的影响 Western Blot结果显示，模型组NF-κBp65蛋白表达较假手术组明显提高；心脑宁胶囊组和依达拉奉组表达量较模型组均显著减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图5。

图5 各组小鼠NF-κB p65蛋白Western Blot表达情况（±s，n=3）

2.7 免疫组化结果 结果显示，染色后细胞核清晰可见，阳性表达若位于细胞核中，颜色进一步加深。假手术组有极个别的阳性表达。模型组NF-κB p65阳性表达最为显著，细胞核呈现团状，提示NF-κB过度活化，阳性细胞呈现聚集现象，提示存在炎性浸润。心脑宁胶囊组阳性细胞数明显减少（P＜0.01）。依达拉奉组阳性细胞数减少更为显著（P＜0.001）。若以积分光密度计算，心脑宁胶囊组与依达拉奉组相当（P＞0.05）。见图 6。

图6 各组小鼠脑组织NF-κB p65表达情况（免疫组化，×200，n=5）

3 讨论

以组织纤溶酶原激活剂（tPA）[9]为代表的药物溶栓和机械取栓[10]作为治疗急性缺血性卒中的方案已初见成效，如何减轻血流恢复供应引起的缺血再灌注损伤成为了心脑血管疾病研究的重点[11]。CI/RI涉及的病理机制复杂，炎症反应在其中扮演了重要角色，抑制甚至阻断炎症反应成为了改善缺血再灌注损伤的理想策略[12]。

NF-κB作为一种能够调控炎症和凋亡的转录因子，在CI/RI中发挥着重要作用。静息状态时，常以NF-κB/Rel-IκB（抑制蛋白）三聚体形式存在于胞浆中。细胞再灌注发生后，细胞受到氧自由基等因素刺激，激活 IκB 激酶（IKK），导致 IκB 磷酸化、泛素化及降解。IκB被降解，p50-p65异二聚体进入细胞核。转移入核后，与靶基因特定序列结合，从而上调相关基因的转录和表达[13]。例如上调细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的表达，其介导中性粒细胞和血管内皮细胞黏附，促进炎性浸润，造成血管内皮损伤[14]；上调肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等细胞因子的表达，能够再次诱导NF-κB的活化，形成炎症损伤循环[15]。作为炎症反应的调节中枢，围绕NF-κB通路的中药脑保护研究为科研人员提供了新的思路。Li等[16]报道银杏双萜内酯可通过TLR4/NF-κB途径抑制大鼠的脑缺血/再灌注诱导的星形胶质细胞炎症反应。川芎嗪可通过下调TNF-α诱导NOS的表达，抑制IKK磷酸化，使NF-κB的表达失活[17]。Jiang等[18]通过高通量筛选结合网络药理分析发现了丹红注射液中9种（丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、羟基红花黄A、红花黄A、丹酚酸A、丹酚酸B和丹酚酸C）通过NF-κB途径发挥抗炎作用的化合物。

本实验研究发现，在缺血再灌注24 h时，模型组小鼠出现了明显的脑水肿，更为广泛的脑梗死，严重的组织病理损伤，其NF-κB p65蛋白的表达显著增加，核转位现象更为突出，提示CI/RI后NF-κB信号通路被激活。心脑宁胶囊对上述各项指标均有明显改善作用，提示其能够抑制NF-κB信号通路的激活，发挥抗CI/RI的作用。

心脑宁胶囊由银杏叶、小叶黄杨、丹参、大果木姜子、薤白5味药物组成，其组方配伍体现出了活血行气、通络止痛的作用特点[19]，广泛应用于心血管疾病的防治，取得了阶段性的成果[20]。其临床文献的干预对象主要集中于慢性稳定型心绞痛和不稳定型心绞痛。有学者提出心脑宁胶囊亦可用于脑卒中及心脑共病（冠心病合并脑卒中）防治，但文献数据较为匮乏[21]。本实验首次探究了心脑宁胶囊对CI/RI的作用，为临床防治缺血性卒中提供了更多参考，但仍存在着一些局限性，例如：1）本实验只涉及动物实验，未在细胞模型进行验证。2）天然植物小叶黄杨和苗药大果木姜子的化学成分相关数据不够完善，在网络药理学分析上可能存在偏差。

综上所述，心脑宁胶囊对小鼠CI/RI具有一定保护作用，可能是通过抑制NF-κB的表达及活化来实现的。本实验通过建立小鼠CI/RI模型，借助网络药理学，并进行了实验验证,初步探究了心脑宁胶囊在动物水平防治CI/RI的可行性。