流相二氧化氯处理对苹果链格孢菌侵染的防治效果及贮藏品质的影响

阎一鸣，张鲜桃，贾晓昱，姜瑜倩，贾红霞，李喜宏,*

（1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津科技大学省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；2.天津绿新低温科技有限公司，天津 300457；3.天津利源捷能气体设备股份有限公司，天津 300392）

苹果，蔷薇科苹果属植物，其所具备的高营养价值及商业价值使之成为人们日常生活中最为常见的水果之一。但是，在其采摘、运输等过程中，不可避免地会受到不同种类的损伤，而破溃部位极易受到真菌病原体侵染，严重影响其食用价值、营养价值及商业价值。其中，由链格孢菌引起的烂果是苹果果实重要的采后侵染性病害之一。目前，尚没有抗烂果病的苹果品种，因此所有的苹果品种均易感染此病[1]。而当前防治该菌常用的化学药剂有硫菌灵、苯菌灵、多菌灵、速克灵等[2]，虽然这些药品均有较好的防治效果，但易残留在果蔬表面，降低果蔬的食用安全性[3]。随着我果对食品安全要求的提高，亟待寻找一种安全、无污染、低毒、低残留的高效抑菌剂解决该困境。

二氧化氯是目前国际上公认的高效、广谱、快速、安全、无污染的第4代灭菌消毒剂，现已在采后葡萄[4]、西兰花[5]等果蔬中开展了保鲜及抑菌效果的研究。它对果蔬表面微生物的细胞壁有较强的吸附力和穿透力，透过细胞壁进入细胞后，一方面作用于含硫基的酶，另一方面氧化核酸（DNA/RNA），控制微生物中蛋白质的合成，使其失活或改性，从而阻止微生物的合成代谢。此外，二氧化氯利用其强氧化性，可以破坏真菌细胞的细胞壁，改变细胞渗透压，使细胞内含物（含氮有机化合物、ATP）泄露，并改变真菌孢子的形状，从而灭活真菌[6]。前人报道称气态抗菌剂比液态更有效[7]，但是制造气态二氧化氯的化学方法存在H2SO4消耗量大、副产物Na2SO4不易回收的难题[8]；其电解法所需设备复杂、生产成本高、产气量不稳定、故障率高、耗电量大等问题均影响了气态二氧化氯的推广和应用[9]。而雾化可以使液体以细雾的形式在空气中扩散，其渗透能力增强，并且比液态抗菌剂更有效，因此，近年来雾化抗菌剂在改善新鲜农产品的安全性方面越来越受到重视[10]。

本研究依据“流水不腐”原理，采用流动微循环处理采后苹果果实，以无菌水处理为对照，研究了80 mg·L-1和400 mg·L-1雾化二氧化氯对链格孢菌的抑制效果，以及对经链格孢菌侵染的苹果的品质影响。通过观察、比较试验组和对照组的苹果果实在贮藏期间的病斑扩展、果实品质、防御性物质含量及防御性酶活性的差异，为采后果实保鲜提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

富士苹果购买于天津市滨海新区某水果批发市场，挑选成熟度、大小、色泽一致且无机械伤及病虫害侵染的果实，运回实验室后，立即用2%二氧化氯溶液消毒2 min，再用无菌去离子水冲洗2次，而后将其置于无菌操作台中风干。处理好的苹果将用于进一步接种试验。

纯种链格孢霉菌购买于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCCAF 207029，于4℃下储存。

1.1.2 仪器与设备

SC250-M040型超声波雾化器：佛山市顺德区巨科电器有限公司；T6型紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；TGL-16型高速冷冻离心机：四川蜀科仪器有限公司；AUY120型电子分析天平：深圳力达信仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅：邦西仪器科技（上海）有限公司；GY-3型硬度计：浙江托普仪器有限公司；PAL-1型手持糖度仪：大连枫洲科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验方案设计

用接种环轻轻刮擦含有活化后的链格孢霉菌的培养基表面，而后将其转移至无菌生理盐水中，制成分生孢子悬浮液。在每个苹果果实的赤道部位用无菌水洗过的钉子刺伤，形成深3 mm、宽3 mm的创面，并将20μL分生孢子悬浮液注射到每个苹果果实的受伤部位，待菌液吸收后，获得接种后的果实。

根据预试验的结果，制备80 mg·L-1和400 mg·L-1二氧化氯溶液用于试验组处理，对照组用无菌水处理。将上述溶液依次放置在超声波雾化器中，雾化后通过长度为64 cm的管子（直径为2.54 cm）引入流相防腐装置中，随着1.5 m·s-1无菌风在密封装置中循环流动。苹果果实接种部位与循环风逆向放置，保证果实与雾化剂均匀接触10 min后取出，用0.04 mm厚的聚乙烯袋进行包装，而后在20℃条件下进行贮藏。分别在试验的0、5、10、15、20、25、30 d对试验组和对照组的苹果果实进行取样，测定各项生理指标。每种处理、每个指标均设置3次重复。

1.2.2 测定项目与方法

1.2.2.1 病斑直径

采用十字交叉法[11]测量。

1.2.2.2 硬度

手持配有直径3.5 mm的圆形柱塞的水果硬度仪，在靠近接种处的赤道位置测定果肉硬度，单位以kg·cm-2表示。每种处理选取3个苹果果实进行测定，每个苹果设2次平行。

1.2.2.3 可溶性固形物（TSS）含量

每种处理取3个苹果果实，每个果实取多个部位的果肉，将其置于研钵中进行充分研磨，用4层纱布过滤，匀浆滴在手持糖度仪检测镜上，记录数据，单位以%表示。

1.2.2.4 可滴定酸（TA）含量

采用氢氧化钠滴定法，具体参照曹建康等[12]的方法，并稍作修改。称取10 g苹果果肉，于研钵中磨至匀浆，转移至100 mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度，上下颠倒摇匀，静置30 min备用。取20.00 mL滤液，转入到三角瓶中，加入2～3滴1%酚酞，用已标定的标准浓度氢氧化钠滴定至溶液初显粉色并在30 s内不褪色时为滴定终点（pH=8.1～8.3），记录氢氧化钠溶液用量，重复3次。

1.2.2.5 丙二醛（MDA）含量

采用硫代巴比妥酸比色法测定，具体参考Zhang等[13]的方法，单位以 μmol·g-1表示。

1.2.2.6 总酚含量

采用Folin-Ciocalteu比色法，具体参照Liu等[14]的方法，单位以mg·g-1表示。

1.2.2.7 过氧化物酶活性

采用愈创木酚法，具体参考曹建康等[12]的方法，单位以U·g-·1min-1表示。

1.2.2.8 多酚氧化酶活性

参考白鸽等[15]的方法，单位以U·g-1·min-1表示。

1.2.2.9 苯丙氨酸解氨酶活性

参考吴芳芳等[16]的方法测定，单位以U·g-1·h-1表示。

1.2.3 数据处理

所有试验数据均至少3个重复，并使用完全随机设计。数据表示为平均值±标准误差。使用统计软件Origin 8.0进行统计分析。采用SPSS13.0进行单向方差分析试验与对照之间的显著性分析。

2 结果与分析

2.1 雾化二氧化氯处理对苹果链格孢菌侵染病斑直径的抑制效果

由图1可以看出，与对照组雾化无菌水处理苹果果实相比，两种浓度的雾化二氧化氯均对链格孢菌侵染的苹果果实有抑制作用。随着贮藏时间的延长，试验组与对照组病斑直径变化逐渐明显。贮藏至15 d时，与对照组相比，80 mg·L-1和400 mg·L-1雾化二氧化氯处理的苹果果实病斑直径分别减小了20.56%和8.19%。由此表明，雾化二氧化氯能够有效抑制经链格孢菌侵染的苹果果实的病斑扩展，其中80 mg·L-1二氧化氯处理组效果更好。

图1 雾化二氧化氯处理对苹果链格孢菌侵染病斑直径的影响Fig.1 Effectsof atomized chlorinedioxidetreatmentson lesion diameters of apples infected with Alternaria alternata

2.2 雾化二氧化氯处理对苹果果实品质的影响

2.2.1 雾化二氧化氯处理对苹果果实硬度的影响

硬度可用来判断果实的软化程度。如图2所示，在贮藏0～10 d内，苹果果实的硬度呈逐渐上升趋势，且试验组和对照组均在第10天达到峰值，此时，经80 mg·L-1雾化二氧化氯处理的果实硬度最大，为13.1 kg·cm-2，之后3组果实硬度均逐渐下降。其中，经雾化无菌水处理的对照组果实硬度下降最快，贮藏第30天降为6.45 kg·cm-2。这可能是由于链格孢菌能够分泌纤维素酶和果胶酶等细胞壁降解酶以破坏宿主的细胞壁，进而加速果实硬度的下降；而雾化二氧化氯能够抑制微生物蛋白质的合成，降低微生物代谢活性，有助于果实硬度的保持[2]。对比两个试验组，经80 mg·L-1雾化二氧化氯处理的果实硬度下降速率更缓，因此延缓硬度下降速率的效果优于雾化400 mg·L-1二氧化氯处理。

图2 雾化二氧化氯处理对苹果果实硬度的影响Fig.2 Effectsof atomized chlorine dioxidetreatmentson firmnessin apples fruits

2.2.2 雾化二氧化氯处理对苹果果实可溶性固形物含量的影响

可溶性固形物是指液体或流体食品中所有溶解于水的化合物的总称，包括糖、酸、维生素、矿物质等[17]，其含量变化可以反映出果实的成熟度、品质波动及代谢活动[18]。如图3所示，在贮藏30 d内果实中可溶性固形物含量波动较大，试验组和对照组的可溶性固形物含量均呈现先上升后下降的趋势，且均在第10天达到峰值。这可能是由于贮藏前期果实中的淀粉逐渐转化为可溶性糖，而后期可溶性糖和有机酸又作为果实呼吸的底物被分解所导致的。贮藏10～30 d，对照组果实的可溶性固形物下降速率大于试验组，因此雾化二氧化氯处理能够有效延缓采后苹果果实品质的下降速率，且80 mg·L-1雾化二氧化氯处理的效果优于400 mg·L-1处理。

图3 雾化二氧化氯处理对苹果果实可溶性固形物含量的影响Fig.3 Effectsof atomized chlorine dioxidetreatmets on solublesolid contents in applesfruits

2.2.3 雾化二氧化氯处理对苹果果实可滴定酸含量的影响

可滴定酸含量能够直接反映果实的品质和成熟度，是品质的重要评价指标之一[19]。由图4可以看出，经链格孢菌侵染后，采用流相技术防腐保鲜的果实，其可滴定酸含量均在第5天达到峰值，其中经雾化二氧化氯处理的可滴定酸含量为0.251%～0.255%，而对照组可滴定酸含量为0.233%，此后3组果实可滴定酸含量在后期贮藏过程中不断降低，且在第5～10天下降速度较快，贮藏10 d之后下降速度减缓。贮藏第20天，对照组可滴定酸含量降至0.164%，而80 mg·L-1雾化二氧化氯和400 mg·L-1雾化二氧化氯处理组的可滴定含量仅分别降至0.177%和0.162%。贮藏后期，试验组的可滴定酸含量下降速率大于对照组，这可能是因外界胁迫而造成的代谢加快引起。

图4 雾化二氧化氯处理对苹果果实可滴定酸含量的影响Fig.4 Effectsof atomized chlorine dioxidetreatmentson titratable acidity contentsin applesfruits

2.2.4 雾化二氧化氯处理对苹果果实丙二醛含量的影响

MDA是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，其产生数量的多少可代表膜脂过氧化的程度，能够直接反映细胞膜的受损程度，间接反映植物组织的抗氧化能力。同时，丙二醛的产生会加剧细胞膜的受损，致使细胞内的各种小分子物质外漏，进而改变细胞内外的渗透压，严重时因内外渗透压的差别过大而使细胞破裂[20]。由图5可以看出，试验组和对照组的苹果在贮藏30 d内，MDA含量均呈现逐渐上升趋势，且与对照组相比，二氧化氯处理能够降低MDA产生的速率。这可能是由于链格孢菌分泌的毒素会破坏宿主细胞膜的通透性，使得胞内电解质外渗[2]，而二氧化氯能够降低微生物活性，延缓MDA的产生，抑制细胞膜结构的损伤，从而有效延缓采后苹果果实的衰老。

图5 雾化二氧化氯处理对苹果果实丙二醛含量的影响Fig.5 Effects of atomized chlorinedioxide treatmentson MDAcontentsin applesfruits

2.3 雾化二氧化氯处理对苹果果实中防御物质含量及防御酶活性的影响

2.3.1 雾化二氧化氯处理对苹果果实总酚含量的影响

酚类化合物是植物体内重要的次生代谢物质，植物受到病原菌侵染后，酚类物质会发生明显变化[21]。由图6可知，贮藏0～20 d内，3种处理的果实总酚含量呈波动式上升。但随着时间的推移，不同处理组的果实总酚含量波动趋势有所不同。20～30 d贮藏过程中，80 mg·L-1雾化二氧化氯处理组的总酚含量保持波动上升的趋势，且在第30天时总酚含量达到815.53 mg·g-1，而400 mg·L-1雾化二氧化氯处理组和对照组总酚含量在贮藏后期逐渐降低。

2.3.2 雾化二氧化氯处理对苹果果实过氧化物酶活性的影响

植物在逆境初期先建立起抗氧化酶的第一道防线对抗自由基的攻击。其中，过氧化物酶（POD）是植物在逆境条件下酶促防御系统的关键酶之一[22]。由图7可知，3种处理的POD活性均在贮藏的第15天发生降低。此时，80 mg·L-1和400 mg·L-1雾化二氧化氯处理组POD活性降至2.75 U·g-·1min-1和1.77 U·g-·1min-1，分别是对照组的2.33倍和1.5倍。且在整个贮藏过程中，对照组的POD活性在贮藏期内始终处于较低水平，而经雾化二氧化氯处理的苹果果实的POD活性呈现波动上升的趋势。贮藏第30天，80 mg·L-1和400 mg·L-1雾化二氧化氯处理组果实POD活性高达4.50 U·g-1·min-1和3.62 U·g-·1min-1，分别是对照组的2.08和1.68倍。由此表明，流相二氧化氯处理有助于提高果实POD活性。

图7 雾化二氧化氯处理对苹果果实过氧化物酶活性的影响Fig.7 Effectsof atomized chlorine dioxide treatmentson POD activitiesin applesfruits

2.3.3 雾化二氧化氯处理对苹果果实多酚氧化酶活性的影响

多酚氧化酶（PPO）是植物体内众多防御物质中的重要种类之一，属于植物抗营养型防御物质[23]。由图8可知，在整个贮藏过程中，PPO活性与其他抗氧化酶活性变化趋势不同，其活性呈现先下降再升高而后又下降的趋势。贮藏第25天，80 mg·L-1雾化二氧化氯处理组果实PPO活性高达1.71 U·g-1·min-1，与400 mg·L-1雾化二氧化氯处理组（0.76 U·g-1·min-1）和对照组（0.64 U·g-·1min-）1之间存在显著差异（P＜0.05）。由此表明，80 mg·L-1雾化二氧化氯处理采后苹果果实可以显著提高PPO活性，并有助于抵御链格孢菌的侵染。

图8 雾化二氧化氯处理对苹果果实过氧化物酶活性的影响Fig.8 Effectsof atomized chlorinedioxidetreatmentson PPO activities in apples fruits

2.3.4 雾化二氧化氯处理对苹果果实苯丙氨酸解氨酶活性的影响

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物苯丙烷类代谢途径的关键酶之一，病原菌侵染和病原菌毒素处理都能诱导苯丙氨酸解氨酶活性增强，且酶活增强与抗病性呈正相关[24]。如图9所示，贮藏期内的PAL活性呈现波动上升的趋势。贮藏第30天时，3种处理的PAL活性均达到最大值，80 mg·L-1雾化二氧化氯处理组PAL活性高达8.51 U·g-1·h-1，400 mg·L-1雾化二氧化氯处理组酶活性为7.25 U·g-1·h-1，分别为对照组的1.25倍和1.07倍。由此说明，流相二氧化氯处理能够提高苹果果实PAL活性，有助于果实防御机制的启动。

图9 雾化二氧化氯处理对苹果果实苯丙氨酸解氨酶活性的影响Fig.9 Effects of atomized chlorine dioxide treatments on PAL activitiesin apples fruits

3 结论与讨论

苹果烂果病通常由链格孢菌侵染所引起，主要发生在采后贮运阶段。传统化学药剂虽然抑菌、保鲜效果好，但是易残留在果实表面，造成其食用安全性降低，进而亟需寻找一种浓度低、效果好的苹果防腐保鲜剂。本试验依据“流水不腐”的原理，在密闭空间内采用流相，即雾化不同浓度二氧化氯处理经链格孢菌侵染的苹果果实，观察病斑扩展情况、苹果品质变化及防御性物质、防御性酶活性的变化情况。Jiang等[10]以圣女果为试验材料，研究不同浓度雾化过氧乙酸、二氧化氯及乳酸、醋酸和乙酰丙酸的混合物灭活沙门氏菌的效果，并认为密闭环境中雾化抗菌剂可以作为圣女果沙门氏菌灭活的新方法。

本试验结果表明，与采用雾化无菌水处理的对照组相比，低浓度和高浓度的雾化二氧化氯处理均能在不同程度上起到抑制链格孢菌侵染及维持苹果品质的效果。一方面能够抑制果实病斑直径增大，起到抑菌效果；另一方面能够延缓果实硬度下降速率，可溶性固形物和可滴定酸含量的降低及丙二醛含量的上升；最后一方面提高果实中防御性物质总酚含量和过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等防御性酶活性，进而有助于维持贮藏过程中的苹果品质。其中，80mg·L-1雾化二氧化氯处理组的效果优于400 mg·L-1雾化二氧化氯处理，这可能是由于二氧化氯浓度过高，使得果实细胞膜透性增加，细胞质外流[25]，加速果实硬度下降速度，从而不利于苹果品质的保持和长期贮藏。此前，余璐璐等[26]用梯度浓度二氧化氯处理草莓果实，研究结果表明：高浓度二氧化氯在抑菌的同时会对果实造成损伤。综上所述，雾化二氧化氯对苹果或其他水果的品质影响，仍需要通过对防御性酶活性的基因表达情况进一步研究确认。流相防腐技术可以作为今后果蔬防腐的研究方向，为寻求高效、低污染的防腐保鲜技术提供新思路。