IL-34在肝癌组织中的差异表达及其临床意义*

谢 飞 王洪斌 张瀚文 郭伟红 刘鹏年△

1.河北一洲肿瘤医院检验科 (河北 涿州, 072750) 2.河北省涿州市医院检验科

肝细胞癌(HCC)是指起源于肝细胞的一种常见恶性肿瘤[1]。在我国恶性肿瘤中，HCC的发病率位于第3位，病毒性肝炎是其主要的发病原因[2]。HCC的早期症状不明显，一旦出现症状，大多数已属晚期。HCC主要致死原因是肿瘤进展后出现浸润和转移等，而肿瘤间质中存在着炎症和免疫的微环境，这种微环境会为肿瘤细胞的转化、生长、增殖和浸润等肿瘤的发生发展提供可能[3]。白细胞介素34(IL-34)是一种新型的细胞因子，其促进巨噬细胞的分化和增殖的原因在于IL-34与巨噬和单核细胞表面所存在的集落刺激因子受体(CSF-1R)结合[4，5]。本研究旨在探讨IL-34在HCC中的差异表达，并分析其临床意义，以期为临床诊断治疗HCC提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 病例资料 选取2017年8月至2019年12月住院的HCC患者54例，肝良性肿瘤患者21例，其中HCC患者均经过肝切除后送病理检查后确诊。HCC患者中男性38例，女性16例；年龄34～69岁，平均(51.22±12.35)岁；肝良性肿瘤患者中男性14例，女性7例；年龄32～71岁，平均(52.73±14.79)岁。

1.2 标本收集 术前抽取空腹患者全血样本6 ml，4℃下4 000 r/min离心10 min，收集血清，置于-80℃冰箱备用。术后采集患者手术切除的HCC组织、相应癌旁组织(采自癌旁1 cm外)以及良性肿瘤组织标本。将组织样本快速存于液氮中，再转移至-80℃冰箱待用。

1.3 实验试剂及仪器 Trizol逆转录试剂盒和实时PCR试剂盒购于Invitrogen公司；Anti-IL-34兔抗人多克隆抗体和IL-34的ELISA试剂盒均由美国Abcam公司提供；PCR引物购自北京擎科公司；实时PCR仪和生化检测仪均购自美国Thermo Fisher公司。

1.4 ELISA检测血清中IL-34表达水平 将-80℃冰箱中保存的血清室温下自然解冻，按照ELISA试剂盒说明书的步骤，使用双抗体夹心ELISA法检测血清细胞因子IL-34的水平。

1.5 实时PCR检测IL-34 mRNA的表达水平 IL-34引物序列：反向5′-GCAGAAAACCCGTGACAGT-3′，正向5′-GGAATGAGCCTTTGGAGAT-3′。GAPDH引物序列：正向5′-TGTGTCCGTC-GTGGATCTGA-3′，反向5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′。按照试剂盒说明书，用Trizol提取样品RNA，将RNA反转录为cDNA，然后进行PCR检测，即向各管中加入含染料2×Ex TaqMix 12.5 μl，再加入10 μmol/L引物混合物0.75 l(即对应的cDNA各1 μl)，向管中补加双蒸馏水，使总体积为25 μl，预留一管用作阴性对照(不加模板)。混匀后置于PCR仪中95℃ 5 min预变性，95℃ 15 s，65℃ 30 s，40个循环。测定PCR产物的浓度和纯度，每个样品设3个复孔。实验结果按照2-△△Ct方法来分析，△△Ct=△Ct(IL-34)-△Ct(GAPDH)。

1.6 Western Blot检测IL-34蛋白的表达水平 将-80℃冰箱中保存的组织样本室温下自然解冻后加入细胞裂解液制备成匀浆液，高速离心后取上清液和缓冲液混匀后待用；配制分离胶和积层胶，蛋白上样后，电泳将蛋白转置于硝酸纤维素膜上；加入Anti-IL-34兔抗人多克隆抗体进行孵育，孵育完成后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，洗膜后加入化学发光试剂进行显影。表达水平使用组织蛋白表达量与内参(β-actin)表达量的比值来计算。

2 结果

2.1 HCC和良性肿瘤患者外周血清中IL-34的水平比较 检测结果显示HCC和良性肿瘤患者外周血清中IL-34的水平分别为(6.84±0.53)和(3.64±0.42)pg/ml，两组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 HCC组织、癌旁组织和良性肿瘤组织中IL-34 mRNA的表达水平比较 见表1。

表1 HCC组织、癌旁组织和良性肿瘤组织中IL-34 mRNA的表达水平比较

2.3 HCC组织、癌旁组织和良性肿瘤组织中IL-34蛋白的表达水平比较 Western Blot检测结果显示，IL-34蛋白在HCC组织中的表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，良性肿瘤组织中IL-34基本不表达，见图1。

图1 HCC组织、癌旁组织和良性肿瘤组织中IL-34蛋白的表达水平 1：HCC组织；2：癌旁组织；3：良性肿瘤组织

3 讨论

IL-34是一种新型的细胞因子，存在于人体中的大多数器官组织中[6,7]。IL-34可结合CSF-1R，从而被认为是单核细胞和巨噬细胞的有效激活剂。IL-34和CSF-1有许多共同的功能特性，两者通过共同的受体介导单核吞噬细胞的生物学行为[8,9]。IL-34引起的巨噬细胞异常活化与许多疾病有关，参与了众多的炎症过程，如Chemel等[10]报道滑膜IL-34表达水平与滑膜炎严重程度呈正相关；IL-34在慢性丙型肝炎患者中表达明显升高，经研究发现IL-34可以促进和激活相关巨噬细胞的分化，从而导致肝硬化的发生发展[11]。

本研究结果表明HCC患者血清细胞因子IL-34水平明显升高，提示IL-34参与HCC的发生发展过程并起了一定作用。通过Western Blot检测HCC患者HCC组织和癌旁组织，以及良性肿瘤患者肝组织中IL-34蛋白的表达，结果表明HCC患者HCC组织中IL-34的蛋白相对表达显著高于相应的癌旁组织及良性肿瘤组织(P<0.05)，证实了IL-34在蛋白水平参与了HCC的病理过程。通过实时PCR检测HCC组织和癌旁组织，以及良性肿瘤组织中IL-34 mRNA的表达，结果表明HCC组织中IL-34的表达显著高于相应的癌旁组织及良性肿瘤组织(P<0.01)，证实了IL-34在基因水平也参与了HCC的病理过程。AKT和ERK1/2信号通路及IL-1β、IL-6 和TNF-γ等重要的细胞因子参与HCC相关病理过程，被认为是HCC治疗的新靶点[12-14]。而IL-34与这些信号通路的关系密切，Zhou等[15]研究发现在成纤维细胞中，IL-34通过激活下游信号，例如MAPK、PI3K-Akt、JAK和NF-κB，上调IL-6、IL-8的表达。研究结果提示IL-34可能在HCC的发生和发展过程中是一个重要的角色，但是IL-34在HCC发生发展中的作用机制有待于进一步的探索。