L-02-hNTCP稳定表达细胞系的建立与鉴定*

李瑞明 贺昱霖 程 彬 魏志强 孟忠吉

十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)生物医学研究所 (湖北 十堰，442000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈全球分布，是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞肝癌的重要原因之一[1，2]。HBV宿主范围有限，组织嗜性狭窄，用于体外感染研究的原代人肝细胞来源困难，阻碍了对HBV完整生命周期特别是病毒感染早期过程的研究，因此有必要建立一种稳定支持HBV感染的细胞模型。本研究在肝细胞系L-02中稳定表达HBV感染功能性受体钠离子牛磺胆酸转运多肽(NTCP)，从而建立高表达hNTCP的L-02细胞系，并筛选HBV易感的克隆，为研究HBV入侵细胞的机制和抗病毒药物筛选提供新的模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 质粒、细菌和细胞细制备 质粒hNTCP又名SLC10A1(Genebank编号：NM_003049，产品编号：CH890269)购自维真生物，骨架质粒为维真生物pENTER载体，含嘌呤霉素抗性基因。hNTCP基因通过限制性内切酶AsiSI/MluI克隆至pENTER载体，同时在hNTCP基因C末端包含一个Flag标签(图1)。大肠杆菌DH5a感受态购自北京天根。人肝细胞系L-02为本室保存。复苏后培养于含10% 灭活胎牛血清DMEM培养基。

图1 hNTCP质粒结构示意图

1.1.2 主要仪器和试剂 酶标仪(德国Eppendorf)，定量PCR仪(美国ABI stepone plus)；荧光显微镜(日本Olympus IX71)；Chamber Slides(美国Thermo Fisher Scientific)；胎牛血清、DMEM培养基、脂质体Lipofectamine3000、Trizol购自生命技术公司；FastQuant RT Kit(With gDNase)购自北京天根；质粒提取试剂盒、定量PCR试剂盒购自罗氏公司；HBsAg和HBeAg EILISA检测试剂盒购自科美公司；Flag抗体DYKDDDDK Tag(D6W5B)Rabbit mAb 购自CST公司；HBcAg兔多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；嘌呤霉素购自青岛生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 hNTCP编码区长1 050 bp，使用NCBI Primer Blast在线设计hNTCP定量PCR引物，跨越第一个内含子，产物全长107 bp：NTCP-U TTGAGGCACTGGCCATCTTG，NTCP-D GTGGTCATCACAATGCTGAGGTT。使用ABI Primer Express设计HBV定量PCR引物及探针，扩增区域位于HBV polyA序列(nt1828-nt1922)：PGP_v1(nt1828-nt1847)CACCTCTGCCTAATCATCTC，BC1_v2(nt1922-nt1903)TTATACGGGTCAATGTCCAT，HBV_qPCR_probe1(nt1853-nt1881)CATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTG，5′标记6-FAM，3′标记BHQ1。全部引物由上海生工合成。

1.2.2 质粒转染及耐药克隆筛选 质粒转染参照Lipofectamine 3000说明书进行。在24孔板中每孔接种1×105个L-02细胞，37℃培养过夜，转染hNTCP真核表达质粒0.5 μg/孔，培养24 h后，换液，加入含0.5 μg/ml嘌呤霉素培养基继续培养4 d，至对照组细胞全部死亡，继续培养1周，显微镜下挑取全部耐药克隆至96孔板继续培养。

1.2.3 免疫荧光检测hNTCP-flag表达及筛选高表达克隆 耐药克隆在96孔板培养1周后，消化接种部分细胞至Chamber Slide，每孔铺1×104个细胞，培养24 h后，参照标准免疫荧光检测流程检测Flag标签。荧光显微镜下观察阳性数目细胞数目及荧光强度，选取最佳克隆继续培养。

1.2.4 hNTCP mRNA水平的定量检测 参照Trizol说明书分离提取L-02-hNTCP细胞总RNA。参照FastQuant RT Kit(With gDNase)说明书合成cDNA，Realtime PCR检测hNTCP水平，扩增参数：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火延伸20 s，循环40次。

1.2.5 HBV病毒感染L-02-hNTCP细胞 参照文献[3]制备HBV感染性颗粒并制备感染性培养基(5×108GEq/ml)。在24孔板中每孔接种1.5×105个细胞，培养24 h，加入感染性培养基，继续培养24 h，PBS洗3遍后换普通培养基继续培养，收集第3、5天培养上清用于HBV抗原ELISA检测。第5天收集细胞抽提核衣壳相关HBV复制中间体，用于定量PCR检测。

1.2.6 免疫荧光检测HBcAg L-02-hNTCP细胞感染HBV 24 h后消化接种于Chamber Slide，培养24 h后按标准免疫荧光程序检测HBcAg。

1.2.7 HBsAg和HBeAg的酶联免疫吸附(ELISA)检测 采用ELISA试剂盒检测培养上清中的HBsAg和HBeAg水平，参照说明书进行检测。

1.2.8 核衣壳相关HBV复制中间体的提取及定量检测 核衣壳相关HBV复制中间体的提取参考文献[4]。实时定量PCR扩增参数：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火延伸20 s，循环40次。

2 结果

2.1 hNTCP稳定高表达细胞系L-02-hNTCP建立 hNTCP质粒转染L-02细胞经过嘌呤霉素筛选最终获得92个耐药克隆，对这些耐药克隆进一步检测hNTCP-Flag表达水平，共筛出2个高表达克隆，取表达水平最高的细胞株命名为L-02-hNTCP。

2.2 L-02-hNTCP细胞系中hNTCP-Flag的表达水平 免疫荧光结果显示，L-02-hNTCP细胞能被Flag抗体特异结合，所有细胞都呈绿色，且阳性区域主要集中于细胞膜。对照组L-02细胞全部为阴性。见图2。

图2 L-02-hNTCP细胞系中hNTCP-Flag的表达(200×)

2.3 共培养后的L-02-hNTCP细胞系中HBcAg表达水平 免疫荧光结果显示，L-02-hNTCP细胞被HBcAb结合，呈现红色荧光，对照组L-02细胞全部为阴性(图3)。

图3 HBV感染性培养基共培养后的L-02-hNTCP细胞系中HBcAg表达的免疫荧光检测(200×)

2.4 L-02-hNTCP细胞hNTCP mRNA表达水平 Realtime RT-PCR相对定量结果显示，相比于L-02细胞，L-02-NTCP细胞系中hNTCP 基因mRNA水平高出(1 205.45±199.49)倍。PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，在107 bp处L-02-hNTCP细胞有很亮的条带，而L-02只有极弱的条带(图4)。

图4 L-02-hNTCP细胞hNTCP mRNA水平(A.实时定量RT-PCR检测hNTCP mRNA表达水平；B.PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳)

2.5 HBV感染性培养基处理后L-02-hNTCP细胞上清中HBsAg和HBeAg水平 HBV感染性培养基处理后第3 d和第5 d，L-02-hNTCP细胞上清中检测到高水平的HBsAg和HBeAg，而同样经过HBV感染性培养基处理的L-02细胞上清仅在第3 d能检测到微量HBeAg。

2.6 HBV感染性培养基处理后L-02-hNTCP细胞内可以检测到高水平复制中间体 在24孔板中，ReaL-time PCR结果显示，HBV感染性培养基共培养后的L-02-hNTCP细胞内HBV复制中间体拷贝数为(6.57±0.36)×106拷贝/孔。

图5 HBV感染性培养基处理后L-02-hNTCP细胞上清中HBsAg和HBeAg水平

图6 HBV感染性培养基处理后L-02-hNTCP细胞内HBV 复制中间体水平

3 讨论

HBV宿主范围狭窄，缺乏稳定易操作的动物感染模型和细胞感染模型。常用的HepG2和Huh7细胞系不能被HBV感染。人原代肝细胞(PHH)、HepaRG细胞以及树鼩原代肝细胞(PTH)可以用于研究HBV感染早期阶段。但是，PHH获取困难，成本高，可用性有限。HepaRG需要长时间诱导分化且感染效率低下。人血清可与HBV颗粒竞争结合到PTH细胞膜降低实验可信度[5-7]。2012年李文辉等[8]首次发现了HBV/HDV感染的功能性受体钠离子牛磺胆酸转运多肽(NTCP)，并证实稳定表达hNTCP的HepG2细胞系可以被HBV感染，这为研究HBV感染早期过程和探索新治疗方法提供了一个便捷的途径。

本研究选用了实验室常用的L-02肝细胞系，转染hNTCP真核表达质粒，经过嘌呤霉素初筛及免疫荧光进一步筛选获得一株hNTCP高表达细胞系L-02-hNTCP。免疫荧光结果显示hNTCP阳性较强区域主要位于细胞膜，这与预期结果一致，hNTCP主要分布于细胞膜；大约30%的细胞具有很强的荧光信号，表明可以进一步筛选得到更纯的高表达hNTCP细胞系，以获得对HBV的更高敏感性。经HBV感染性培养基处理后，L-02-hNTCP细胞内检测到了HBcAg，表明病毒颗粒进入了细胞内；在培养基上清中检测到HBsAg和HBeAg，说明HBV侵入L-02细胞后开始表达HBV相关抗原。但是与质粒转染相比，HBsAg和HBeAg表达强度明显偏低，可以参照文献[9，10]在后续的实验中用更高浓度的药物筛选及DMSO诱导刺激细胞分化以获取高敏感稳定表达的HBV感染细胞系；第5d在24孔板中培养L-02-hNTCP细胞中HBV复制中间体DNA拷贝数达到数量级106。

本研究构建的L-02-NTCP稳定表达细胞系能被HBV感染性颗粒感染，并且表达HBV相关抗原，细胞内能检测到HBV DNA。在之前的研究中，我们建立了HBV临床分离株的克隆方法，并成功克隆了7个野生型HBV克隆[11]，结合L-02-NTCP过表达细胞系将为进一步研究HBV早期生命周期，以及探索治疗HBV感染新技术提供了一个很好的细胞模型。