液相色谱质谱MRM-IDA-EPI模式靶向分析生姜中的代谢产物

李东芹

(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070)

生姜是多年生姜科植物姜的新鲜根茎，是世界上最广泛使用的香辛调味料，也是中国传统的药食两用型植物[1]。生姜中除了含有丰富的蛋白质、维生素和多糖等营养物质外，还有姜黄素、姜辣素及其衍生物等功能性活性成分[2]，这些活性成分具有抑菌消炎、抗氧化、抗血脂、抗肿瘤、改善阿尔茨海默症等药理作用[3-6]，因此生姜在食品、药品、化妆品[7]等行业都具有良好的应用前景和社会效益，而分析鉴定这些有效化学成分又是生姜开发利用的前提。随着分析仪器的飞速发展，质谱技术[8-11]逐渐取代了原有的紫外分光光度法[12]和液相色谱[13-14]分析方法。现有的质谱技术在生姜研究中的应用[15-16]，都是针对一种或者几种主要姜辣素物质的定量分析，对生姜氨基酸、姜辣素衍生物等的研究非常少。因此，本试验建立液相色谱质谱靶向代谢组学分析方法，以期为生姜遗传育种、品质分析、医药应用及保健品开发研究提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

生姜、仔姜、老姜（华中农业大学菜市场采购，产地为山东安丘）；6,8,10-姜酚、姜酮、姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素（以上标品均为HPLC 级，纯度≥98%。成都克洛玛生物科技有限公司）；混合氨基酸标准品5 mL（sigma 公司）；Beta-烟酰胺单核苷酸（≥98%，质谱级，医恩医疗系统研发（上海）有限公司生产）。

1.2 仪器与试剂

4000 Qtrap 串联三重四级杆线性离子阱质谱仪（美国AB Sciex 公司）， LC-30AD 高效液相色谱仪（日本岛津公司），Milli-pore 超纯水仪（美国Millipore 公司），超声波（宁波新芝），万分之一天平（梅特勒公司），蠕动泵（Hamilton 公司），离心浓缩仪（Eppendorf 公司），甲醇（色谱纯，默克公司），超纯水，乙酸（色谱纯），醋酸铵（色谱纯），1 mL 医用注射器，0.22 μm 微孔滤头（上海安普）。

1.3 样品制备

将生姜、老姜和仔姜切成5 mm 左右的碎片，分别称取2 g 左右置于10 mL 的密封瓶内，加入5 mL 80%甲醇水溶液，室温过夜萃取[15]。用1 mL 针筒过滤器取上清，经0.22 μm 滤头过滤后加入进样瓶，待用。

1.4 对照标准品溶液制备

准确称取姜黄素、6,8,10-姜酚、姜酮、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素标准品于50 mL 容量瓶内，用甲醇定容后作为母液备用。

准确移取50 μL 混合氨基酸标准液AAS18 到25 mL 容量瓶内，并用超纯水稀释定容为氨基酸母液备用。

1.5 试验条件

1.5.1 色谱条件 岛津Shim-pack VP-ODS C18（150 L×2.0 mm，5 μm）色谱柱，样品室温度为室温；流动相：A 为3 mmol·L-1的醋酸铵水溶液（V/V），B 为含0.1%乙酸的乙腈溶液（V/V）；流速为0.25 mL·min-1。梯度洗脱条件为：0～5 min，B 从5%升至50%，5.0～10 minB 从50%升至100%，20.0～15 min 为100%的B, 25.1～30 min 为5%的B。柱温箱的温度为40 ℃，进样量为10 μL。

1.5.2 质谱条件 采用电喷雾（ESI）离子源，选用MRM-IDA-EPI 扫描模式，正、负离子实时切换进行定性、定量分析。电喷雾电压5 500 V；离子源温度：500 ℃；离子源辅助气GS1/GS2 气流均为50 L·h-1。

2 结果与分析

2.1 色谱与质谱条件优化

基于氨基酸、姜辣素和姜黄素类化合物都具有一定的极性，适合反相液相色谱分离模式。本研究选用岛津ODS C18 色谱柱，考察了甲醇-水和乙腈-水体系的分离效果，乙腈-水作为流动相时代谢物的的分离度和信号强度优于甲醇-水体系；由于姜辣素和姜黄素类化合物都含有酚羟基团，为了抑制色谱峰拖尾，需要在乙腈-水流动相中分别添加0.1%的乙酸和3 mmol·L-1的醋酸铵溶液；又因为生姜提取液中代谢产物较多，极性差异较大，选用梯度洗脱方式能达到更好的分离效果。故本文最终选择1.5.1中描述的液相分离条件。

图1 生姜代谢物的TIC 总离子流图Figure 1 TIC chromatograms of the metabolites in ginger

图2 6-姜烯酚色谱图和二级质谱图Figure 2 Extracted ion chromatogram and product ion spectra of 6-shogaol

混合氨基酸、姜黄素、6, 8,10-姜酚、姜酮、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素等有标准品的化合物，通过针泵注射器进样手动优化其解簇电压（DP）、入口电压（EP）、碰撞能量（CE）和碰撞出口电压（CXP）等质谱参数; 其他没有标准品的化合物，MRM 离子对（Q1/Q3）参考文献［16］，DP、EP、CE、和CXP 参数是通过自动进样器连续采集3 种生姜的混合提取液，不经色谱柱分离，质谱FIA 自动优化模式优化后得到。各化合物的详细参数信息见表1。

在本研究优化的色谱质谱条件下，生姜代谢物在正负离子模式下都能得到很好的分离和质谱响应强度，正离子模式下各化合物的总离子流色谱图如图1 所示。

表1 生姜中目标代谢物分析的MRM 转换Table 1 MRM transitions for targeted metabolite analysis in ginger

续表1

2.2 生姜中氨基酸类、姜辣素类、姜黄素类代谢物的质谱靶向分析

2.2.1 无对照品化合物的定性分析 采用4000 Qtrap质谱仪特有的MRM-IDA-EPI 关联扫描模式，一针进样，不仅能得到用于定量分析的MRM 色谱图，还可以同时得到该化合物的二级质谱图。对于没有标准品的化合物，二级质谱图主要用于定性确认峰位置。因为姜辣素类化合物及其衍生物多为结构类似的同系物，质谱裂解比较有规律，有较多相同的碎片离子，MRM 色谱图可能会出现一个以上不同保留时间的色谱峰。以姜烯酚类物质为例，6-姜烯酚的MRM 色谱图在9.07 min、11.62 min 出现两个色谱峰（图2(a)），2 个色谱峰对应的二级质谱图分别为图2 中的(b)和(c)。由二级质谱图(b)和(c)可以很容易判断出(b)对应的色谱峰为6-姜烯酚，而(c)是分子量为354.0 的化合物的二级质谱图，它恰好也可以裂解出质量数为277 和137 的离子碎片。 所有代谢物的色谱保留时间信息见表1。

2.2.2 鲜姜、老姜和仔姜中氨基酸含量的差异分析3 种生姜都含有非常丰富的游离氨基酸。氨基酸总量和人体必需氨基酸总量都是老姜中最高，鲜姜次之，仔姜最低，具体见图3(a)；3 种生姜氨基酸含量分布热图（图3(b)）显示，每种氨基酸在3 种生姜中含量差异明显，大部分氨基酸在老姜、鲜姜和仔姜中的含量依次降低，赖氨酸的含量分布反而是依次升高；同一生姜中不同氨基酸含量分布也有明显差异，仔姜中除了赖氨酸积累较多外，其他的氨基酸含量都相对较低；鲜姜中含量前3 位的依次是缬氨酸、赖氨酸和精氨酸；老姜中含量最高的是精氨酸，其次是芳香味氨基酸酪氨酸，含量最低的是谷氨酸。导致氨基酸代谢物种类和含量分布差异的原因还有待于进一步研究。

图3 鲜姜、老姜和仔姜中氨基酸含量分布Figure 3 The distribution of different amino acids in fresh ginger, old ginger and tender ginger

2.2.3 鲜姜、老姜和仔姜中姜辣素类化合物的含量差异分析 姜辣素类化合物主要包括姜酚、姜烯酚、姜酮以及它们的甲基化和乙酰化衍生物。它们不仅是生姜的主要呈味物质，也是其药理作用的主要功能因子[16]，对姜辣素类物质的定性和定量分析是生姜开发利用的前提。本研究主要对这几类物质进行含量差异分析。从3 种生姜姜辣素含量分布热图4可看出，衍生物1-脱氢-6-姜酮，在3 种生姜中含量都非常高，但品种间差异不太明显；3 种生姜中姜酚、姜烯酚、姜酮及其甲基化衍生物含量分布规律是老姜中最高，仔姜中含量最低，这与他们风味上的辛辣程度相符；而姜酚系列乙酰化衍生物的含量分布规律正好与之相反，都是仔姜中含量最高，老姜中含量最低。

图4 鲜姜、老姜和仔姜中姜辣素类物质含量分布热图的可视化分析Figure 4 Heat map visualization of the relative difference of gingerols in fresh ginger, old ginger and tender ginger

图5 鲜姜、老姜和仔姜中姜黄素类物质含量的差异分析Figure 5 Content distributions of curcuminoids in fresh ginger,old ginger and tender ginger

2.2.4 鲜姜、老姜和仔姜中姜黄素类物质含量差异分析 现有研究结果表明，姜黄素类物质具有抗肿瘤、消炎、抗氧化、降血脂等作用[17-18]。本研究可测定生姜中5 种姜黄素类物质，其中四氢和六氢姜黄素在3 种生姜中都只有少量检出，含量差异不明显；姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素为生姜中最主要最常见的3 种姜黄素类物质，它们在鲜姜、老姜和仔姜中的含量分布结果（图5）表明：姜黄素在3 种生姜中的含量几乎没有差异，脱甲氧基姜黄素在老姜中含量最高，在仔姜中含量最低，而双脱甲氧基姜黄素则是在仔姜中含量最高，在鲜姜中含量最低，导致其含量分布差异的生物学原因还不清楚。

3 结论

利用美国AB SCIEX 公司的4000 Qtrap 质谱仪特有的离子阱富集功能，建立MRM－IDA—EPI 关联扫描模式下正负离子实时切换的靶向代谢组学分析方法。该方法可在30 min 内同时定性、定量检测生姜中60 种代谢产物，具有一次性分析化合物更多、分析时间更短及灵敏度更高的优点；该方法一针进样可同时得到用于定量的MRM 色谱图和用于定性的二级质谱图，能对未知化合物进行精确的定性、定量分析，可有效解决标准品昂贵或者买不到的现实问题。应用该方法对鲜姜、老姜和仔姜中的代谢产物进行分析，结果发现3 种生姜中氨基酸、姜辣素和姜黄素类化学物，在化合物种类及相对含量上都存在明显差异，正是这些差异导致它们在风味、药效和生理作用上的差别。

本试验旨在建立生姜代谢产物的检测方法，未对造成这些代谢物差异的原因进行深入研究。深入研究这些代谢物的代谢路径和含量差异原因，对生姜遗传育种和改良研究有非常重要的意义。