干燥工艺对马蹄大黄产地加工效果的影响

卢 琪，薛淑静，杨 德，王少华，刘 益，李 露*

(1. 湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，武汉 430064；2. 长江大学生命科学学院，荆州 434023)

大黄为蓼科植物，是一味常用大宗药材，历代本草均有收载，富含蒽醌、蒽酮、萘苷类、酰基糖苷类、茋类及鞣质等活性成分，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效，广泛用于医药中间体提取、中药饮片生产、中成药生产和保健品生产，市场领域十分广阔[1-4]。恩施州所产大黄，其基源为药用大黄，因加工的大黄药材产品形如马蹄，又称马蹄大黄，是恩施州的特色道地药材。马蹄大黄适宜在海拔1 300 m 左右的地区生长，生长采收周期为3 年，具有药效稳定、产量高等特点，是恩施州高山乡镇实施产业扶贫和实现稳定脱贫的好产业。

中药历来注重来源及产地加工方法，不同种类、不同产地加工方法，其质量差异较大[5]。大黄常采用炕干法进行干燥，此外还有烘干、晾干、晒干等[6]。研究表明，炕干方法不仅时间长达7 d 以上，产品质量难以把控、极易造成大黄品质下降[7]。大黄主根较粗大，不易干燥，熏干、晾干、晒干过程缓慢，可能造成大黄干燥过程中霉变、走油、色泽和气味的裂变等，导致大黄干燥效率低、品质不均一等[8]。此外，大黄中含有丰富的活性成分，如鞣质类、二蒽酮类、游离蒽醌类及结合蒽醌类，通过提高干燥温度或减小切片厚度，能定向加工出清热泻火型大黄，即最大程度保留结合型蒽醌[9]。谭鹏等[10]将大黄定制成5 mm 的薄片，45 ℃连续干燥8 h，能够保留游离蒽醌总量和番泻苷A、B 的含量，而另有研究表明大黄在50 ℃条件下干燥不利于番泻苷A的累积[11]。上述研究尚缺少对大黄产地加工效率和加工品质的统一考察。

为确保马蹄大黄道地药材质量，实现马蹄大黄的规范、高效加工，获得品质优良、性状均一的加工产品，探讨研究马蹄大黄产地加工工艺迫在眉睫。本研究在探讨干燥效率的基础上，对比各干燥条件下马蹄大黄的成分含量和抗氧化性能，以期建立马蹄大黄高效、优质的产地加工工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 马蹄大黄于2019 年12 月采收于湖北省恩施州利川市，品种鉴定为药用大黄（Rheum officinaleBaill.），选取三年生的马蹄大黄为研究对象。

色谱级标准品（决明柯酮、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄甲醚）及分析试剂（Folin-Ciocalteu 试剂、抗坏血酸、2, 2-二苯基-1-苦基肼基（DPPH）、1, 3, 5 - 三（2-吡啶基）-2, 4, 6 - 三嗪（TPTZ）均购于源叶生物科技有限公司。ABTS·+试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。其他常规分析纯化学品购于国药化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备 酶标仪（Multiskan GO），美国Thermo Fisher 公司；热风干燥机（DHG-9140），上海一恒科学仪器有限公司；超声波清洗仪（KQ5200DE），昆山市超声仪器有限公司；超高效液相色谱仪（Waters Acquity)，美国Waters 公司；液相色谱柱(UPLC BEH C18，100 mm × 2.1 mm, i d.,1.7 μm)，美国Waters 公司；色差仪（CR-400），日本Minolta Camera 公司。

1.2 方法

1.2.1 大黄干燥工艺 新鲜的马蹄大黄洗净、晾干。按照市场要求，将马蹄大黄鲜样切分至4～5 cm 左右的厚度，进行干燥：（1）连续干燥，50、55、60、65、70、75 和80 ℃，热风干燥；（2）结合传统发汗工艺进行马蹄大黄干燥。大黄干燥过程中发汗一次，时长12～24 h[6]，然而发汗中后期大黄质量无进一步的减少，影响干燥效率。本研究在结合干燥效率和传统干燥模式的前提下，采用间歇式的干燥模式，即干燥4 h 后间歇2 h（模拟发汗），如此往复，直至马蹄大黄含水量少于15%[12]，干燥温度设置为：60、65、70、75 和80 ℃。

1.2.2 成分检测 参考中国药典2015 版的要求[12]对马蹄大黄蒽醌类成分进行提取。大黄干燥后粉碎（过4 号筛），称取0.15 g，加入甲醇25 mL，加热回流1 h，冷却，补足体积，过滤，得到甲醇提取液。取甲醇提取液5 mL，挥发去溶剂，加8%盐酸溶液10 mL，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，冷却后置于分液漏斗中分液，取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3 次，合并，减压蒸干，残渣用甲醇复溶后过滤，得到酸解萃取液。将甲醇提取液和酸解萃取液分别进行UPLC-Q-TOF-MSn 分析。流动相（A）蒸馏水/甲酸（0.1%，V/V）；（B）甲醇。洗脱程序：0 min，85%A；5 min，65%A；15 min，45%A；27 min，15%A；29 min，85%A；32 min，85%A；流速0.3 mL·min-1，UV-Vis 采集范围210～600 nm，检测波长为254 nm。质谱条件：负离子模式，离子源源温度120 ℃；锥气流，50 L·h-1； 去溶剂温度，450 ℃；脱溶剂气流，800 L·h-1。样品锥电压和毛细管电压分别为30 V 和2 500 V。

1.2.3 水分干燥速率 用105 ℃干烘箱燥大黄至恒重，检测大黄水分含量。大黄水分干燥速率按照不同干燥时间大黄重量变化程度计算[13-14]，公式如下：

X0，大黄初始重量；Xt,干燥一定时间大黄重量；Xe,大黄干燥绝对重量。

1.2.4 总酚与总黄酮 采用Folin-Ciocalteu 方法计算大黄中总酚含量，结果用每克干大黄中没食子酸当量表示（mg·g-1）。采用NaNO2-AlCl3-NaOH 方法计算大黄中总黄酮含量，结果用每克干大黄中芦丁当量表示（mg·g-1）。

1.2.5 抗氧化能力分析 DPPH 自由基清除能力[15-16]：

将65 μmol·L-1的DPPH 乙醇溶液280 μL 与20 μL抗坏血酸标品或大黄粉的甲醇提取液（如1.2.3 所述）混合，置于96 孔板中，放置30 min，酶标仪517 nm 下读数。大黄DPPH 自由基清除能力以每克大黄粉中毫摩尔抗坏血酸当量表示（mmol·g-1）。FRAP 铁离子还原能力[15-16]：20 μL 大黄粉的甲醇提取液或抗坏血酸标品与280 μL Ferric-TPTZ 试剂混合，放置30 min，酶标仪593 nm 下读数。FRAP 值表示为每克大黄粉中抗坏血酸当量（mmol·g-1）。ABTS·+自由基清除能力[15-16]：按照试剂盒说明书要求制备ABTS·+工作溶液。10 μL 大黄粉的甲醇提取液或水溶性维生素E（Trolox）标品与200 μL 的ABTS·+工作液混合，放置6 min，酶标仪734 nm 下读数。大黄ABTS·+值以每克大黄粉中trolox 当量表示（μmol·g-1）。

1.2.6 统计分析 每组实验重复3 次，数据结果用平均值±SD 值表示。采用IBM SPSS Statistics 20.0进行数据处理，选择Duncan 分析进行样本单因素方差分析，P＜ 0.05 为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 天麻干燥过程中水分变化速率

50～80 ℃条件下连续热风干燥马蹄大黄，使其水分含量满足药典要求，需要48～96 h，干燥过程中马蹄大黄水分含量变化速率如图1 所示。高温干燥虽然能耗大，但能够促进水分散失，提高干燥效率[17]。唐古特大黄，切片（3 cm）后干燥，45～85 ℃条件下需要19～56 h[2]，远小于本研究的干燥时间，可能与不同大黄品种的个体大小有关。本研究的马蹄大黄个大、饱满，单个重约2 000 g，切片的重量约250 g，干燥难度较大。60～80 ℃条件下模拟发汗处理，间歇干燥马蹄大黄，干燥时间需要60～96 h。 间歇干燥过程中马蹄大黄水分含量变化速率如图2 所示。相比连续干燥，相同温度下间断干燥耗时较长，但能充分利用余热，有利于水分由内而外的散出，所以间歇干燥能耗少，节能环保。传统大黄发汗工艺，即干燥中途发汗一次，时长12～24 h[6]，颇为耗时，不符合马蹄大黄的高效干燥工艺的要求。本研究采用间歇干燥法的同时兼顾发汗工艺，有利于大黄干燥效率的提高。

图1 不同温度连续干燥过程中马蹄大黄的水分变化速率Figure 1 The changes of moisture rates in horseshoe shaped Rheum officinale Baill. during continuous drying at different temperature

图2 不同温度间断干燥过程中马蹄大黄的水分变化速率Figure 2 The changes of moisture rates in horseshoe shaped Rheum officinale Baill. during intermittent drying at different temperature

2.2 马蹄大黄蒽醌类成分推断及定量分析

马蹄大黄甲醇提取物、酸解产物及5 种标准品的液相色谱图如图3 所示。按照液相出峰的紫外吸收光谱、出峰顺序以及质谱离子碎片信息，结合前人的文献报道，对马蹄大黄提取成分逐一进行定性分析[18-20]，结果如表1 所示。峰10～14 对应5 种标准品，分别是芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄甲醚。峰10 的分子离子峰为m/z 269.1[M-H]-，峰1 的分子离子峰为m/z 431.1[M-H]-，两者相差162，即峰1 中存在葡萄糖基。芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷在大黄中存在量大，能够分离制备[18]，推测峰1 为芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷。根据质谱信息和紫外吸收图谱，峰2 为番泻苷，峰3 为决明柯酮-8-O-葡萄糖苷[21]。峰6 的分子离子峰m/z 449.1[M-H]-，比峰3（m/z 407.1[M-H]-）多42，推测峰6 比峰3 多一个乙酰基，为决明柯酮-8-O-乙酰基葡萄糖苷。按同样的推断方式，结合液相出峰顺序，峰4、5、7、8 和9 分别为大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-乙酰基葡萄糖苷、大黄甲醚-8-O-葡萄糖苷和大黄甲醚-8-O-乙酰基葡萄糖苷[19-20]。 按照药典要求，大黄经甲醇提取后进行盐酸水解，可将化合物中的糖苷键打开，使糖基游离出来，形成对应的苷元[15]。 如图3 所示，经酸解后，峰1 芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷消失，其对应的苷元芦荟大黄素（峰10）明显增加；峰4、5 和7 消失，三者对应的苷元大黄酚明显增加（峰13）；峰8 和9 消失，二者对应的苷元大黄素甲醚明显增加（峰14）。大黄素和大黄酚（峰11 和12）在甲醇提取液中含量微弱，且未发现对应的糖苷，但在酸解液峰11 和12 均有所增加，推测大黄素和大黄酚可能以聚合体或多种微量糖苷的形式存在。 酸解可以简化成分，方便计算，但操作繁琐，且不能全面反应成分组成，故本研究对大黄甲醇提取液直接进行分析。糖苷化合物采用其对应苷元的标品进行相对定量，即峰1 采用芦荟大黄素标曲定量，峰4、5 和7 采用大黄酚标曲定量，峰8 和9 采用大黄素甲醚标曲定量，其他3 种成分，峰2、3 和6 均采用紫外吸收光谱接近的大黄素标曲定量。

马蹄大黄甲醇提取液中共鉴定得到的14 种成分，其中蒽醌类成分13 种，蒽醌类成分含量占总成分的85.31%～95.65%，各干燥条件下的成分含量如表2 所示。采用70 和80 ℃连续烘干得到总蒽醌类化学成分总和最高，而60 ℃间接干燥蒽醌类总含量最低。分析对比糖苷类成分及其对应的苷元，如芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷与芦荟大黄素；大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-乙酰基葡萄糖苷与大黄酚；大黄甲醚-8-O-葡萄糖苷、大黄甲醚-8-O-乙酰基葡萄糖苷与大黄甲醚，得到如下规律：（1）连续干燥和间歇干燥，随着的温度苷元类成分（芦荟大黄素、大黄酚与大黄甲醚）逐渐减少，而与苷元对应的各类糖苷则呈增加趋势，说明随着烘干时间的延长，糖苷类化合物逐渐水解，形成其对应的苷元[6]；（2）大黄酚及其葡萄糖苷是马蹄大黄中主要的蒽醌类化合物；（3）间歇干燥，即模拟发汗干燥，相比同温度的连续干燥，延长了干燥时间，更加剧了糖苷类蒽醌物质的水解，且总蒽醌类成分的含量并未因模拟发汗处理得到改善。

图3 马蹄大黄甲醇提取物、酸解产物及5 种标品的液相色谱图Figure 3 Liquid chromatograms of methanol extracts, acidolysis products and five commercial standards of horseshoe shaped Rheum officinale Baill.

表1 UPLC-Q-TOF-ESI-MSn 推断马蹄大黄提取成分Table 1 The identification of chemical compounds extracted form horseshoe shaped Rheum officinale Baill. by UPLC-Q-TOF-ESI-MSn

表2 马蹄大黄甲醇提取蒽醌类化学成分的定量分析Table 2 Quantitative analysis of the anthraquinones of methanol extract of horseshoe shaped Rheum officinale Baill. μg·g-1

2.3 马蹄大黄总酚、总黄酮及抗氧化能力分析

各干燥条件下马蹄大黄甲醇提取液的总酚、总黄酮含量及抗氧化能力（DPPH、FRAP、ABTS）对比如表3 所示。通过相关性分析，发现总酚和总黄酮之间具有良好的相关性（相关系数，r2= 0.787），而总酚、总黄酮与总蒽醌类成分的相关性较差。本研究中马蹄大黄甲醇提取物中除蒽醌类物质外，马蹄大黄提取液中存在其他的酚类或黄酮类成分。前人研究表明，大黄药材中存在没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、白藜芦醇葡萄糖苷等其他酚类化合物，其中儿茶素是主要成分[22-23]。相同温度下，连续干燥马蹄大黄的各抗氧化能力要优于间歇干燥，可能与糖苷键的水解有关，糖苷键对酚类成分抗氧化性能尤为重要[24]。对比抗氧化能力，80 ℃连续干燥的马蹄大黄具有最强的DPPH、ABTS 自由基清除能力，50 ℃连续干燥的马蹄大黄具有最优的铁离子还原能力，但整组实验的铁离子清除能力无显著差异。

表3 不同干燥条件下马蹄大黄总酚、总黄酮及抗氧化能力对比Table 3 Comparison of total phenolic content, total flavonoid content and antioxidant capacity of horseshoe shaped Rheum officinale Baill. under different drying conditions

3 讨论与结论

恩施利川的马蹄大黄饱满、粗壮，难以干燥，干燥速率是制约其产地加工的重要因素。本研究按市场对马蹄大黄原料的要求，将其切成厚片（4～5 cm），进行连续热风干燥和间歇热风干燥（模拟发汗工艺）。研究结果表明，马蹄大黄中有14 种活性成分，包含11 种蒽醌类成分，马蹄大黄中的蒽醌类成分多以糖苷的形式存在，与前人的研究基本一致[25]。提高干燥温度或减小切片厚度，能减少大黄加热时间，最大程度保留结合型蒽醌，从而定向加工出清热泻火型大黄[9]。本研究发现干燥过程中蒽醌类成分的糖苷键逐渐水解，形成游离的苷元，干燥速率越慢，糖苷水解越严重。糖苷键对酚类成分抗氧化性能尤为重要，这一水解过程可能影响后续大黄提取成分的抗氧化能力。

各干燥条件下，80 ℃连续干燥，马蹄大黄蒽醌类成分总量最多，60 ℃间歇干燥蒽醌类成分总量最少。相同温度下，间歇干燥充分利用余热，干燥马蹄大黄能耗小于连续干燥，但连续干燥的蒽醌成分含量、抗氧化性能均要优于间歇干燥。80 ℃连续干燥马蹄大黄，干燥速率快，总蒽醌、总酚、总黄酮含量高，抗氧化能力强，最适于马蹄大黄的干燥。本文仅针对2019 年11 月采收的三年生大黄进行研究，不同成熟期和采收时间的马蹄大黄的干燥工艺需要进一步研究、验证。