镉胁迫下蚯蚓(Eisenia fetida)生物标志物的应激响应研究

曹志凡，冷 欣，张靖华，吕 喆，杨吉强，安树青

(南京大学生命科学学院，南京 210046)

采矿、工业作业、农业施肥和垃圾处理等人为活动造成日益严重重金属污染现状[1]。2014 年的全国土壤状况调查公报显示镉的点位超标率位居所调查的8 种重金属第一位，且耕地、林地、草地等多种土地利用类型土壤中的主要污染物均包含镉在内[2]。由于镉具有不易代谢、不可逆、难以监测和表面聚集的特性，通过食物链镉逐步在生物体内富集。富集的镉破坏生物体细胞结构并造成氧化应激[3]，具有致突变性和致癌性[4]，还干扰细胞正常的DNA 的修复机制[5]。近年来，国际组织和国内环境保护部门已达成共识，仅监测重金属含量并不能预测有害物质对生态系统的实际影响，因此关于污染土壤生态安全评价与风险预警的研究在世界范围广受关注，建立土壤生物预警风险评价体系具有重要的意义[6]。

作为自然界中最古老的生物之一，蚯蚓已经存在了6 亿年。大多数陆地环境中，蚯蚓在维持土壤的基本特性以及肥力和生产力方面起着至关重要的作用。蚯蚓生活在食物链的底部，对污染物具有一定的耐受性[7]，由于与土壤的强相互作用以及对大多数污染物的敏感性，蚯蚓被广泛用作陆地生态毒理学研究，并已被视为受污染土壤的指示动物[8]。

近年来，众多学者使用细胞和分子水平的生物标志物作为污染物暴露和环境风险效应的重要评估指标，并建立了各种类型的参数模型，用以整合不同层次上的生物标记物信息[9]。IBR 和BRI 是其中两类代表性的模型[4,9]。IBR 方法基于星状图，其可靠性高度依赖于生物标志物的选择和排列顺序。由于不需要绝对控制或参照组，IBR 方法常用于野外调研[10]。BRI 依赖于对照控制，通过计算处理组生物标志物的偏离程度来实现模型构建[11]。为了比较分析两种模型的优缺点及各自的适用性，本实验将其用于镉污染下蚯蚓的生态毒理研究。

实验中，蚯蚓(Eisenia fetida)暴露于添加重金属镉的人工土壤中30 d。培养结束后测算表征蚯蚓种群生长繁殖指标的日增重倍数和日增殖倍数，并测定多种生化指标，主要包括能源有机物（糖原和可溶性蛋白含量），抗氧化酶（过氧化氢酶，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽硫转移酶活性），脂质过氧化产物（丙二醛含量），金属结合蛋白（金属硫蛋白含量）。研究目的如下：（1）分析镉胁迫下蚯蚓各种生物标志物的响应规律；（2）建立综合指数模型，整合生物标志物信息，综合评价土壤污染状况和环境生态风险。（3）比较BRI 及IBR 两类模型，分析优缺点及各自适用范围，在此基础上进一步设想利用生物标志物进行环境风险评价的应用前景。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

供试试剂：CdCl2·5H2O 试剂，分析纯规格；泥炭土；高岭土（Al2(Si2O5)(OH)4），分析纯规格；石英砂（主要成分为SiO2）。

供试蚯蚓：蚯蚓选取OECD 在蚯蚓毒性实验和繁殖实验中使用的赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)[12-13]。购买的蚯蚓在人工土壤中预培养一周以适应室内环境，培养室温度25 ℃，培养土含水率40%。选取健康成熟、环带明显、虫龄2 个月以上且体重超200 mg的蚯蚓为实验对象。

供试土壤：人工土壤按照OECD 制定的准则配制，包含以下成分：10%泥炭土（风干，2 mm 筛分，无肉眼可见植物残体）；20%高岭土（高岭石含量在30 %以上）；70%石英砂（风干200 目筛分；混合均匀后，用CaCO3调节pH 至6 左右）[12-13]。使用去离子水将人工土壤的含水量调节到约40%。

1.2 微宇宙实验

1.2.1 实验设计 实验开始前，用去离子水清洗蚯蚓，放置在浸湿的滤纸上，黑暗条件下清肠24 h，清除肠道内的杂物。将经过肠道清洁处理的蚯蚓清洗干净，并用滤纸擦干后挑取实验蚯蚓用于人工土壤微宇宙实验。

根据《土壤环境质量标准（GB 15618-2018）》[14]将微宇宙实验中重金属Cd2+浓度梯度设定为0 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1, 1 mg·kg-1和10 mg·kg-1。所选的培养箱为的圆柱形玻璃器皿（40 cm×90 cm），每个培养箱中加入1 kg 的人工土壤，将CdCl2·5H2O 用去离子水溶解后均匀喷洒到人工土壤中，达到预设浓度，在室温下放置48 h 以上，待金属溶液完全浸入土壤中，向人工土壤中加入少量的去离子水，使土壤含水率达到40%左右。选择30 条经过清肠处理的蚯蚓，用分析天平称重，然后置于培养箱中人工土壤表面，待其主动进入土壤。将培养箱放置在恒温培养室（25 ℃）中30 d，在此期间通过添加去离子水保持土壤含水率在40%左右。为每种重金属处理浓度设置3 个重复。

1.2.2 样品采集与生物标志物测定 培养30 d 后，取出蚯蚓，观察蚯蚓生长状况，统计各处理组中蚯蚓数量。清肠后，用分析天平称重各处理组的蚯蚓，计算蚯蚓的日增重倍数和日增殖倍数[15]：

日增重倍数=(培养一段时间后蚯蚓生物量－初始蚯蚓生物量)/(初始蚯蚓生物量×培养时间)（a）

日增殖倍数=(培养一段时间后蚯蚓总数量－初始蚯蚓数量)/(初始蚯蚓数量×培养时间)（b）

样本储存于—70 ℃冰箱中以待测。测定时，各处理组样品分别加入100 mL PBS缓冲液（NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 1.54 g，蒸馏水定容至100 mL），样品在冰水浴条件下人工充分研磨成匀浆液， 4 ℃、3 000 r·min-1离心20 min 后，取上清液，生化指标的测定方法如表1 所示。

表1 生化指标测定方法Table 1 Determination methods of biochemical indexes

1.3 综合指数模型

为了更好地解释重金属胁迫下蚯蚓生物标志物信息，使用Hagger 等建立的生物标志物响应指数及Beliaeff 等建立的综合生物标志物响应指数来评价不同浓度重金属镉下生物所受的环境污染压力[11,23]。

1.3.1 生物标志物响应指数 BRI 具体的计算方法如下：

首先定义一个数值R表示实验组中生物标志物与对照组的偏离度，当有轻微改变（R＜20%）、中等改变（20%≤R＜50%）、较大改变（50%≤R＜100%）、严重改变（R≥100%）时，指定值为4、3、2、1；同时，生物标志物根据其组织生理水平及重要性，赋予相应权重（W）。根据Piva 等人的建议[24]，并结合Hagger 等在不同生物组织水平上对生物标志物的赋值[11]，通常将1.0 的权重分配给因污染暴露而直接响应的生物标志物，这些标志物不一定表征毒性反应的开始，包括MT、抗氧化酶（SOD、CAT、GST）和能量指标（Gn、SP）；将1.2 的权重分配给生物体受胁迫下的有害代谢产物，包括MDA；将3.0 的权重分配给生理终点指标，如生长繁殖（日增重倍数、日增殖倍数）。然后根据下面的公式计算BRI，得到的BRI值在0～4 之间，对应的生物健康状态等级如表2 所示。

其中:Bt和Bc分别为实验组和对照组的生物标志物的活性或者含量，Si和Wi分别为第i种生物标志物的指定值和权重。

1.3.2 综合生物标志物响应指数 综合生物标志物响应指数的计算方法如下：

（1）均一化。对于每一种生物标志物，首先计算其在各实验组测定结果的平均值mi，以及该种生物标志物的在所有组中总的平均值M与标准差S。然后对各实验组的mi按下式进行均一化处理，式中Yi为mi经过均一化处理后的数值。

表2 基于生物标记物响应指数的生物胁迫等级划分[11]Table 2 Classification of biological stress levels based on biomarker response index

（2）赋值。定义数值Zi，如果与对照组相比实验组的生物标志物被激活，则Zi=Yi，反之Zi= -Yi。定义 |Ymin| 为 所有实验组中均一化数值最小值的绝对值，则每一实验组该种生物标志物的得分Bi如下：

（3）绘制IBR 星状图并计算面积。绘制正九边形星状图，将各实验组中9 种生物标志物的得分Bi以星状图中辐射线的长度来表示，连接九条辐射线末端所围成的面积即IBR的数值，设相邻两条辐射线所围成的三角形的面积为Ai，则：

由于9 种生物标志物在星状图中的排列顺序会影响IBR的计算结果，因此本研究中考虑了9 种生物标志物的全部排序，并计算20 160 种IBR 值的平均值作为最终值。

1.4 统计分析

使用SigmaPlot 12.5 软件作数据统计和图表处理，采取单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan 多重比较法对不同处理间的差异性进行显著性分析（R 3.5.1），以P＜0.05 作为显著性检验标准。

2 结果与分析

2.1 日增殖倍数和日增重倍数

随着重金属镉浓度的增加，各处理组蚯蚓的生长繁殖指标均受到抑制（图1）。在镉浓度为0.1 mg·kg-1时，蚯蚓的日增重倍数显著降低（P＜0.05），而镉浓度为1 mg·kg-1时，蚯蚓的日增殖倍数才发生显著改变（P＜0.05），表明镉对蚯蚓繁殖的抑制作用滞后于对蚯蚓生长的抑制作用。当镉浓度为10 mg·kg-1时，蚯蚓的日增殖倍数和日增重倍数均最低，此时蚯蚓的日增重倍数接近于0，表明蚯蚓种群在一定程度的重金属环境压力下已停止增重。

图1 蚯蚓的日增殖倍数和日增重倍数Figure 1 Daily proliferation rate and daily weight increment rate of earthworm

图2 蚯蚓的各种生化指标Figure 2 Biochemical indexes of earthworm

图3 生物标志物响应指数及综合生物标志物响应指数Figure 3 Biomarker response index and integrated biomarker response index

2.2 生化指标

图2 显示了测定的各种生化指标。与对照组相比，实验组的糖原含量显著降低（P＜0.05），可溶性蛋白质的含量显著增加（P＜0.05）；随着镉浓度的升高，蚯蚓体内SOD 酶的活性先升高后降低，在0.1 mg·kg-1的镉浓度下达到最大值（P＜0.05）；而MDA的含量呈现先降低后升高的趋势，在10 mg·kg-1镉处理的实验组中达到最大值（P＜0.05），CAT 酶、GST 酶的活性和MT 的含量随镉浓度升高均显著提升（P＜0.05）。

2.3 综合指数模型

随着镉暴露浓度的增加，BRI 呈现出明显的下降趋势。当镉浓度为0.1 mg·kg-1、1 mg·kg-1和10 mg·kg-1时，BRI 分别为3.39、2.70 和2.33，表明蚯蚓在不同重金属浓度下分别面临着轻度胁迫、较大胁迫和严重胁迫。

图3（a）中辐射线的长度反映各种生物标志物在实验组间的差异，在各实验组间差异较大的生物标志物有日增殖倍数、CAT、GST 和MT。星状图的面积即IBR 数值与生物体所受的污染压力正相关[9,23,25]。随着镉暴露浓度的增加，IBR 呈现明显的上升趋势。当镉浓度为0.1、1 和10 mg·kg-1时，IBR分别为3.71、7.94 和13.41，表明环境胁迫效应随着镉浓度增加而加强（图3（b））。

3 讨论与结论

蚯蚓摄取有机物后，通过肠道与土壤中的污染物接触。重金属被摄入后经过扩散、迁移、转化和排泄等复杂的代谢解毒途径排出体外。然而，相当一部分的重金属仍然在体内积累，造成多层级的生物毒性效应。蚯蚓的生物毒性效应首先发生在分子水平，通过级联模式逐步体现在组织、器官、个体及种群等水平[26-27]。

3.1 日增殖倍数和日增重倍数

蚯蚓的生长和繁殖指标对重金属胁迫非常敏感[28]，研究这些指标有助于评价重金属的毒性作用。日增重倍数和日增殖倍数可以分别表征蚯蚓种群的生长和繁殖指标[15]。研究发现在高浓度重金属的胁迫下，蚯蚓种群的生长繁殖显著减缓。而随着重金属浓度的上升，蚯蚓的生长指标表现出了更高的敏感性，当镉浓度为10 mg·kg-1时，蚯蚓生长趋于停滞。在高浓度镉的影响下，蚯蚓的多个生殖器官如环带可能受到损伤，进而降低其繁殖水平。研究表明多种有机污染物和重金属都能造成蚯蚓生殖器官不同程度的损伤，从而影响蚯蚓的存活率、性发育、孵化率、产卵率和种群密度[28-30]；蚯蚓生长率的降低可能与其在污染胁迫下的生存策略有关，即通过减少食物摄入来避免摄入物质的毒性作用[31]，或者通过节约生长所需的能量来抵抗外部环境压力[32]。

3.2 生化指标

重金属被蚯蚓吸收富集后，导致蚯蚓体内的蛋白质、核酸等生物大分子失活，影响蚯蚓正常的生理生化代谢。通过测定蚯蚓生物体的能量指标，可以准确反映蚯蚓在重金属胁迫下的代谢活动。Beaumelle 等人的研究表明，能量调节和调度是蚯蚓对污染压力的一种重要抵抗机制，蚯蚓在不同的重金属条件下会采取差异化的应对策略[9]。本研究的结果表明镉胁迫抑制蚯蚓的糖原指标，促进可溶性蛋白质。糖原是生物体主要的能量来源，在高浓度镉胁迫下，蚯蚓可能会加强糖原的代谢，以获得抵御毒性作用所需的能量[33-34]；可溶性蛋白质是渗透调节和营养大分子，其含量的增加有助于蚯蚓在压力环境中维持正常的生理平衡。高浓度镉可能诱导一些功能性蛋白质的合成，这些功能性蛋白可以结合或代谢重金属以降低镉的毒性作用[7,35]。

当机体受到氧化应激时，抗氧化酶系统起到清除过量自由基的作用，避免应激因素对机体的过度损伤。GST、SOD 和CAT 是抗氧化酶系统中的3种关键性酶，广泛分布于生物体内。它们的活性指标常被用作指示土壤污染的生物标志物[36-37]。SOD是首先与活性氧自由基反应的特效酶，生成H2O2中间产物，CAT 可以催化H2O2生成无毒的H2O，从而降低氧化应激压力[38]。GST 能清除细胞内的脂质过氧化物和活性氧，其所携带的谷胱甘肽可与多种自由基和重金属离子结合，在抗氧化过程中起着重要作用[36,39]。在低浓度镉暴露下，SOD 活性显著升高，表明镉诱导蚯蚓机体产生活性氧自由基，触发SOD 的抗氧化防御机制[35]，然而，随着镉暴露浓度升高，胁迫进一步加强，SOD 活性降低，这可能是由于毒性反应积累的大量活性自由基导致细胞正常代谢紊乱，从而抑制了SOD 的活性，该假设也在多篇文献中得到了证实[37,39-41]；在实验组中，CAT和GST 都表现出较大的偏离度，其活性随着重金属浓度的升高显著增强，是抗氧化酶体系中最敏感的生物标志物。结果表明，在重金属的胁迫下，细胞产生的自由基导致了中间产物过氧化氢和过氧化脂质的积累，诱导CAT 和GST 的活性增强[25-42]；生物标志物MDA 可以显示脂质过氧化水平。作为自由基作用于脂质过氧化的次生代谢物，其含量反映蚯蚓在逆境中的氧化应激程度[38-39]。研究发现，低浓度镉暴露下（0.1 mg·kg-1，1 mg·kg-1）MDA 的含量较对照组下降，这可能是由于低浓度的镉诱导金属硫蛋白和抗氧化酶等表达，这些关键功能蛋白可以保护细胞免受自由基的攻击，使其维持低脂质过氧化水平[36]，镉浓度升高至10 mg·kg-1，MDA 含量高于对照组，表明应激反应产生的自由基超已出蚯蚓自身的代谢能力，导致生物膜的过氧化[43]。MT是一种富含巯基、低分子量的金属结合蛋白，能螯合重金属并将其排出体外，保持体内重金属含量的稳定[44]。镉暴露可诱导MT 合成，随着镉暴露浓度的提高，蚯蚓体内MT 含量有所上升，与对照组的偏离度逐渐增加，表明MT 是蚯蚓抵抗重金属毒害作用的重要蛋白，同时也是一种能指示环境重金属压力的敏感生物标志物。

3.3 综合指数模型

蚯蚓的多种生理指标对重金属有复杂的响应，其中一些指标表现出不规则的变化趋势，综合指数模型的构建避免了单一生物标志物波动的不可预见性，综合评价3 种重金属浓度下蚯蚓所面临的环境压力[11,23]。BRI 和IBR 的计算结果均显示，环境胁迫效应随着镉浓度增加而加强。BRI 还反映在3 种不同浓度的镉暴露下蚯蚓分别面临着轻度胁迫、较大胁迫和严重胁迫。

实验结果表明两种指数可以有效地将复杂的生物标志物响应整合成单一的生物健康和环境评价质量参数。早期的研究大多仅使用以生物标志物为基础的综合指数评估野外环境风险[45]，而本实验创新地将两者应用在指示生物的室内生态毒理研究中。然而相较于BRI，IBR 在本实验中体现出了如下缺点：（1）IBR 的计算方法比较复杂，星状图构建高度依赖于各种生物标志物的排序，9 种生物标志物的在星状图上的排序有20 160 种之多，而BRI 直观简单，不需要考虑生物标志物的排序；（2）IBR 不对各类生物标志物分配权重，鉴于星状图面积的运算方法，当生物标志物的数量较少时，个别生物标志物的波动会给IBR 的计算值带来很大的影响。而BRI 可以通过给敏感性生物标志物分配较高的权重，避免生物标志物种类较少时的评估偏差；（3）IBR 运算过程中不考虑对照组的参照作用，无法实现实验组之间的横向比较，因此IBR 更适用于野外环境风险评估。BRI 实现了对照控制，通过室内对照组及野外清洁站点的设置可以推广其适用范围。此外BRI 还对污染风险等级进行了定性划分，便于归类环境胁迫等级。通过多次实验比较不同污染类型下生物标志物的敏感程度，从而筛选监测该种污染物的理想生物标志物类型并合理分配权重，BRI可以直观、准确地评估生物体在个体、生理生化、分子等不同层级上对污染压力的响应，建立生物标志物与污染胁迫的对应关系[46]。

综上所述，本研究通过室内微宇宙实验分析多项生物标志物在重金属胁迫下的响应规律，利用综合指数模型整合生物标志物信息，各项实验结果、结论为环境土壤镉污染的早期预警和后期评估提供理论基础。在两类综合指数模型中， BRI 有着更为突出的优势和更广的适用范围。随着研究的深入，未来可筛选单一及复合污染下的敏感生物标志物，并尝试确定各污染情境下的理想生物标志物类型及其权重，细化胁迫等级的划分，建立一个更为精确的生物标志物—污染胁迫程度对应模型，指示野外土壤环境风险评价。

镉对蚯蚓的生长繁殖具有显著的抑制作用，作用效果因重金属浓度的提升而加剧，且生物量增长指标更为敏感。

随着环境中镉浓度的升高， SP、CAT、MT 和GST 的含量或活性显著提升，而MDA、Gn 的含量先增后减，SOD 的活性先升后降，表现出不规则的变化趋势。综合指数模型BRI 和IBR 均表明环境胁迫效应随着镉浓度的增加而提升，此外，BRI 显示重金属镉浓度为0.1、1 和10 mg·kg-1时，蚯蚓分别面临着轻度胁迫、较大胁迫和严重胁迫。