五味子对禽源大肠杆菌临床分离株抗生素敏感性的影响

陶 娅，江 苏，胡婧婧，魏思敏，伯若楠*，刘明江，李金贵*

(1. 扬州大学兽医学院，扬州 225009；2. 江苏省动物重要疫病与人畜共患病防控协同创新中心，扬州 225009)

抗生素作为饲料添加剂被广泛用于养殖业，其在预防和治疗细菌性传染病方面发挥了巨大作用。但如今，抗生素的不合理使用使细菌耐药性增强的问题日益显著[1]，并且长期依靠抗生素维持畜禽健康状态，容易引起环境和动物性食品中出现抗生素残留，从而进一步威胁食品安全和人类健康[2]。2019年农业农村部发布的《中华人民共和国农业农村部公告第194 号》[3]公告，将全面禁止促生长类药物饲料添加，因此寻找新的途径解决细菌耐药性变得更加迫切，越来越多的目光聚焦于中草药。研究表明，中药及其有效成分具有抗菌作用、毒副作用小和来源广泛等特点[4]。中国药典记载，五味子分为木兰科五味子（Schisandra chinensisBaill.）和华中五味子（Schisandra sphenantheraRehd. et Wils.），前者称为北五味子，后者称为南五味子[5]。研究表明五味子具有抗菌、抗氧化和抗炎等多种药理活性，对多重耐药菌株也具有抑制作用[6-7]。本研究通过微量肉汤稀释法检测南北五味子水煎液单独或联合抗生素对禽源临床分离大肠杆菌（Escherichia coli）耐药株的体外抑菌活性，明确五味子对何种抗生素具有增效抑菌作用，为五味子的临床开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂 南五味子购自于安徽省亳州市，北五味购自于河北省安国市，所有药材均经扬州大学兽医学院李金贵教授鉴定。6 种畜禽常用抗生素购自上海吉至生化科技有限公司，包括恩诺沙星（enrofloxacin、ENR）、氨苄西林（ampicillin、AMP）、链霉素（streptomycin，STR）、头孢噻呋（ ceftiofur，CEF）、卡那霉素（kanamycin、KAN）和多西环素（doxycycline，DOX）。细菌培养基均购于青岛高科园海博科技有限公司，按通用组方配制成Luria-Bertani（LB）液体培养基、Luria-Bertani 琼脂培养基、Mueller-Hinton（MH）液体培养基以及麦康凯培养基。

1.1.2 菌株 禽源大肠杆菌临床分离株分别命名为：E. coli0220E1-1、0313E1-1、0322J1-1、0 503J1-1、0503J4-2、0513J2-2，以上菌株由扬州大学兽医学院畜禽门诊部王彦红博士提供。标准菌株E. coliATCC 25 922 由本实验室保存。

将E. coli从-80 ℃取出于LB 液体培养基复壮并增菌培养2～3 代，吸取菌液接种于麦康凯培养基保存，挑取单个菌落接种于LB 液体培养基，在37 ℃ 摇床中培养至对数生长期。

1.1.3 南、北五味子水煎液及抗生素母液的制备分别称取南、北五味子粗粉各100 g，加蒸馏水1 000 mL，浸泡1 h 后，加热沸腾后持续30 min，提取3次，合并煎煮液，使用6 层纱布过滤。旋转蒸发至200 mL，即得到生药量0.5 g·mL-1的南五味子水煎液（SRD）和北五味子水煎液（SCFD），装入试管中，置于-20℃冰箱保存，备用。精确称取各种抗生素，用各自对应的缓冲液将抗生素配制成浓度为20 480 μg·mL-1的母液，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）的测定 采用96 孔板微量肉汤稀释法分别测定SRD、SCD 和6 种抗生素对E. coli0220E1-1、0313E1-1、0322J1-1、0503J1-1、0503J4-2、0513J2-2以及ATCC 25922 的MIC 值。取无菌96 孔板，每孔加入MH 培养基和待测药液进行连续二倍稀释，于稀释后的孔中加入预先摇至对数生长期并稀释至每毫升1.0×105菌落总数（colony-forming unit，CFU）的菌液100 μL[8]。每个96 孔板设置药物阴性对照、MH 阴性对照和菌液阳性对照。置于37 ℃恒温培养箱内培养18～24 h 后，为避免SRD 和SCD 颜色对MIC 结果的干扰，将96 孔板每孔吸取10 μL 滴于LB 琼脂培养基，培养基置于37 ℃培养18～24 h后观察细菌生长情况，最小无菌生长的浓度即为MIC。质控菌株选用E. coliATCC 25922 标准菌株，所有抗生素和培养基均在质控范围内。

1.2.2 抗生素与SCD 联合药敏试验 通过微量棋盘稀释法测定SCD 与ENR、AMP、STR、CEF、KAN和DOX 这6 种抗生素联合使用时的分级抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）来判定其相互作用。将SCD 和抗生素在MH 肉汤培养基内梯度稀释为 2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC 和1/16MIC，于稀释后的孔中加入预先摇至对数生长期并稀释至每mL1.0×105CFU 的菌液，并设置药物阴性对照、MH 阴性对照和菌液阳性对照。于37 ℃恒温培养箱内培养18～24 h 后，将96 孔板每孔吸取10 μL 滴于LB 琼脂培养基，培养基置于37 ℃ 18～24 h 后读取结果，以无细菌生长的最低药物浓度为联用MIC。通过公式计算FICI，进而判断五味子水煎液与其他抗生素联用的作用效果。

FICI 判读结果如下：FICI≤0.5，协同作用；0.5＜FICI≤1，相加作用；1＜FICI≤2，无关作用；FICI＞2，拮抗作用[9]。

1.2.4 SCD 与CEF 联合使用对E. coli生长的影响将E. coli标准菌株ATCC 25922 活化后培养至对数生长期，用无菌生理盐水稀释，调整菌液浓度至每毫升105CFU，以1%接种量接种于MH 培养液中。分为以下4 个组：对照组、1/4MIC SCD、1/4MIC CEF和1/4MIC SCD+1/4MIC CEF。37 ℃，180 r·min-1培养24 h，在0、2、4、6、8 和24 h 无菌取样，采用平板计数法，将菌液逐级稀释混匀，取100 μL 涂平板，37 ℃培养18 h 后进行菌落计数。每个时间点重复涂布3 块平板，计算各个时间点下细菌菌落数并绘制生长曲线。

2 结果与分析

2.1 SRD、SCD 与抗生素的MIC

SRD、SCD 与6 种抗生素对6 株临床分离E. coli的MIC 结果见表1、表2。结果表明临床分离的6种E. coli对本试验采用的6 种抗生素至少出现2 种及以上的耐药。6 株临床分离株SCD 的MIC 均为64 mg·mL-1；除0503J4-2的MIC 大于128 mg·mL-1外，其余5 株临床分离株SRD 的MIC 均为128 mg·mL-1。结果表明SCD 与SRD 均具有抑菌活性，SCD 抑菌活性高于SRD。因此后续试验采用SCD 进行。

表1 抗生素对6 株临床分离E. coli 的MICTable 1 MICs of different antibiotics for 6 clinical E. coli isolates

表2 五味子水煎液对6 株临床分离E. coli 的MICTable 2 MICs of SCD and SRD for 6 clinical E. coli isolates

2.2 抗生素与SCD 联合体外抗E. coli 活性

采用微量棋盘稀释法，将SCD 和6 种不同的抗生素对临床分离的5株耐药E. coli进行联合抑菌试验，结果见表3、表4。由表3 可知SCD 与KAN联合使用，4 株耐药菌株中有1 株呈现相加作用；3株为无关作用。SCD 与STR 联合使用，6 株耐药菌株中有1 株呈现相加作用；5 株呈现无关作用。SCD与DOX 联合使用，6 株耐药菌株均呈现无关作用。SCD 与ENR 联合使用，6 株耐药菌株均呈现拮抗作用。SCD 与CEF 联合使用，5 株耐药菌株均呈现协同作用。结果表明SCD 能有效增强体外CEF 的抗E. coli的活性。

由表4 可知0220E1-1、0313E1-1、0503J1-1、0503J4-2和0513J2-2在SCD 与CEF 联合使用时FIC 分别为0.25、0.375、0.5、0.5 和0.312 5，均呈现协同作用。

2.3 SCD 对E. coli 生长的影响

采用平板计数法绘制E. coli标准株ATCC25922 生长曲线，分析SCD 对E. coli生长的影响。由图1 可知SCD 对ATCC 25922 有较强的抑菌活性，SCD 处理过的E. coli标准株ATCC25922其生长受到明显抑制，且抑制效果呈浓度依赖性。同样说明SCD 对E. coli具有抑菌活性。

表3 抗生素联合SCD 对临床耐药菌株的FIC 分析Table 3 Results of antibiotics in combination with SCD for drug resistance of E. coli

表4 SCD 与CEF 联合试验结果Table 4 Results of CEF in combination with SCD for drug resistance of E. coli

图1 SCD 对ATCC 25922 生长的影响Figure 1 Growth curve of ATCC 25922 treated with SCD

图2 SCD 与CEF 联合对ATCC 25922 生长的影响Figure 2 Growth curve of ATCC 25922 treated with SCD combined with CEF

2.4 SCD 与CEF 联合使用对E. coli 生长的影

采用平板计数法绘制E. coli标准株ATCC25922 生长曲线，分析SCD 与CEF 联用对E.coli生长的影响。由图2 可知经1/4MIC SCD 和1/4MIC CEF 联合处理后的ATCC25922 相较于1/4MIC SCD和1/4MIC CEF单独处理的生长受到明显抑制，ATCC25922 增长量维持在一个较低水平，其生长被抑制。说明SCD 能增强临床分离耐药E.coli对CFE 的敏感性。

3 讨论

细菌性疾病严重危害人类和动物健康，尤其是畜禽养殖业。目前，抗生素仍然是防治细菌病的首选药物。但由于细菌对临床使用的多种抗生素均产生了耐药，且耐药谱不断增加，可用于治疗的抗生素选择性越来越有限，而新型抗菌药物的研发仍处于滞后状态[10-11]。故越来越多的研究者将目光转向耐药菌自身，如提高耐药菌株对抗菌药物的敏感性、逆转耐药性等[12]。

从中草药中提取抗菌活性物质应对细菌耐药成为近年来的研究热点之一，研究表明五倍子、黄连、大黄、厚朴、丁香、蒲公英和五味子等具有抑菌活性[13-14]，其中五味子提取物具有抗氧化、抗哮喘和提高智力等活性[15-16]，其水提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌等多种细菌均具有抑制活性[17]。五味子中的主要化学成分包括木脂素类、挥发油和有机酸等，其中发挥主要活性作用的为木脂素类，约占总量的8%[18]，研究表明木脂素具有肝保护、抗炎、抗菌和抗HIV-1 等生物学活性[19]。按结构分可将木脂素分为联苯环辛烯类（A型）、螺苯骈呋喃型联苯环辛烯类（B 型）、4-芳基四氢萘类（C 型）、2, 3-二甲基-1, 4-二芳基丁烷类（D型）和2, 5-二芳基四氢呋喃类（E 型）五大类[20]。有研究表明SCD 中木脂素类化合物含量由明显高于SRD[21]，本试验结果显示SCD 抑菌活性强于SRD，该差异是否由木脂素类含量导致，需要进一步探究。由于南北五味子价格相近，且SCD 的抑菌活性强于SRD，故选择SCD 与抗生素联用开展抑菌试验。结果发现SCD 与ENR 联合呈现拮抗作用，与CEF 联合呈现协同作用。这表明SCD 可与CEF联合使用，可考虑用于增强临床耐药株对CEF 的敏感性，提升耐药菌感染的治疗效果并降低药物用量；而SCD 与ENR 联合使用表现为拮抗作用，故临床使用时需要特别注意。时间-杀伤曲线进一步证明了SCD 能够剂量依赖性地抑制耐药E. coli菌株生长，其与CEF 联合应用时对细菌生长的抑制作用更明显，也表现为协同抑菌作用，但其作用机制还有待于进一步研究。