东方拟无枝酸菌产万古霉素发酵工艺优化

王会会，姜明星，戴 梦，葛鹍鹏*，鞠加学*，任风芝，张雪霞

(1.微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心 华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北 石家庄 050015；2.华北制药华胜有限公司，河北 石家庄 050015)

万古霉素(Vancomycin)是由东方拟无枝酸菌发酵产生的一种糖肽类抗生素[1]，早期由美国礼莱公司开发生产，1958年获FDA批准上市[2]。万古霉素通过抑制细胞壁中磷脂和多肽的生成来干扰细胞壁的合成，从而抑制细菌的生长和繁殖[3]。20世纪80年代，随着β-内酰胺类抗生素的大量使用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染逐渐流行。万古霉素是临床治疗MRSA严重感染的重要药物[4]，越来越受到研究者的关注，应用日渐增多[5]。国内万古霉素生产厂家主要是浙江新昌制药、浙江海正药业、福星医药、重庆大新药业及华北制药等几家大型企业[6-7]，销量逐年递增。

为提高发酵单位、降低产品成本[8]，作者在对实验室菌株(东方拟无枝酸菌V19-07)进行选育的基础上，对其发酵工艺进行优化，包括发酵温度、发酵液pH值、通气量和溶解氧浓度等，以期为万古霉素规模化生产奠定基础。

1 实验

1.1 菌株与培养基

东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)V19-07，由华北制药华胜有限公司提供。

种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20.0，蛋白胨5.0，NaCl 5.0，K2HPO40.3，pH值7.0～7.2。

发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖30.0，玉米淀粉80.0，酵母粉10.0，低温豆饼粉15.0，NaCl 1.0，KH2PO40.1，pH值7.0～7.2。

1.2 仪器

Innova 2300型发酵摇瓶机，美国New Brunswick Scientific；FUS-15L型种子罐、FUS-50L型发酵罐，上海国强生化工程装备有限公司；LC-2030C型高效液相色谱仪，日本岛津公司；LXJ-ⅡC型低速大容量多管离心机，上海安亭。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

摇瓶培养：将培养6 d的斜面挖块0.5 cm2接种于装有30 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、220 r·min-1摇床振荡培养24～28 h。

发酵培养：将种子液以0.5%的接种量接种至10 L种子培养基中，在培养温度为28 ℃、通气量为1.0 vvm、搅拌转速为350 r·min-1的条件下培养24 h；然后以5%的接种量接种至30 L发酵培养基中，搅拌通气培养7 d后放罐。

1.3.2 测定方法

菌丝量的测定：将发酵液摇匀，吸取10 mL左右记为V1；3 000 r·min-1离心10 min，读取上清液体积V2，按下式计算菌丝量(%)：

发酵效价的测定：取发酵液1.0 mL，用pH值为1.8～2.0的硫酸定容至10 mL，静置60～90 min后于3 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样测定发酵效价。HPLC检测条件：Symmetry Shield RP18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为pH值3.2的乙腈-四氢呋喃-2‰三乙胺水溶液(体积比7∶1∶92)；柱温30 ℃；流速1.0 mL·min-1；进样量20 μL；检测波长280 nm。

1.3.3 发酵工艺优化

采用单因素实验分别对影响东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素的发酵温度(26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃)、发酵液pH值(6.8、7.0、7.2、7.4)、通气量(0.8 vvm、1.0 vvm、1.2 vvm、1.5 vvm)和溶解氧浓度(0%、10%、20%、30%)等因素进行优化。

2 结果与讨论

2.1 发酵温度对东方拟无枝酸菌发酵产万古霉素的影响

发酵温度通过影响生物体内的酶促反应来调控微生物的代谢，进而影响次级代谢产物的合成[9]，是影响微生物发酵初级和次级代谢的重要因素之一。将培养液以5%的接种量接种至30 L发酵培养基中，在通气量为1.0 vvm、搅拌转速为350 r·min-1、发酵温度分别为26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃的条件下培养7 d，考察发酵温度对东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素的影响，结果如图1所示。

图1 发酵温度对菌丝量(a)和发酵效价(b)的影响

由图1可知，不同发酵温度下，2 d内菌丝均能快速生长，菌丝量迅速增加；之后随着发酵时间的延长，菌丝量总体呈增加趋势，28 ℃发酵7 d的菌丝量达到最高，为60%。但菌丝存在自溶现象，不利于发酵产万古霉素，尤其在32 ℃时，菌丝自溶更加明显，5 d后发酵效价明显下降；而26 ℃、28 ℃、30 ℃时，发酵效价基本呈直线上升趋势，在7 d放罐时达到最高，其中，28 ℃时的发酵效价最高，达到13 457 U·mL-1。因此，选择东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素的最佳发酵温度为28 ℃。

2.2 发酵液pH值对东方拟无枝酸菌发酵产万古霉素的影响

发酵液pH值的变化是微生物代谢活动的综合反映。微生物在代谢过程中，迅速改变发酵液pH值的能力十分惊人，除与培养基成分有关外，决定性因素还是微生物自身的代谢特性。微生物生长繁殖和代谢合成产物都有最适的pH值范围，因此，发酵过程中，必须使发酵液pH值保持在最适范围内[10]。东方拟无枝酸菌V19-07在发酵产万古霉素的过程中消耗碳源持续产酸降低了发酵液的pH值，不利于菌株生长和代谢合成产物，需要通过补加氨水来调节pH值。

将培养液以5%的接种量接种至30 L发酵培养基中，通过补加20%的氨水来控制发酵液pH值分别为6.8、7.0、7.2、7.4，在发酵温度为28 ℃、通气量为1.0 vvm、搅拌转速为350 r·min-1的条件下培养7 d，考察发酵液pH值对东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素的影响，结果如图2所示。

图2 发酵液pH值对菌丝量(a)和发酵效价(b)的影响

由图2可知，不同发酵液pH值下，2 d内菌丝均能快速生长，菌丝量迅速增加；之后进入次级代谢过程，菌丝量出现波动，在发酵液pH值为7.0和7.4时，发酵6 d后菌丝自溶明显，菌丝量减少。不同发酵液pH值下，随发酵时间的延长，发酵效价基本呈直线上升趋势，其中发酵液pH值为7.2时的发酵效价最高，发酵7 d达到13 513 U·mL-1。因此，选择东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素的最佳发酵液pH值为7.2。

2.3 通气量对东方拟无枝酸菌发酵产万古霉素的影响

东方拟无枝酸菌发酵产万古霉素属于好氧发酵，因此，发酵过程中必须不断通入一定量的无菌空气。发酵液中溶解氧浓度大于微生物呼吸的最低氧浓度时，微生物才能正常生长和代谢合成产物。通气量就是单位时间内(通常为每分钟)通入到发酵液中的气体体积[11]。发酵过程中，通气量由微生物呼吸需氧的多少决定。微生物呼吸需氧越多，通气量就越大，反之则小。确定最佳通气量不仅能提高发酵效率，还能节约能源。

将培养液以5%的接种量接种至30 L发酵培养基中，在发酵温度为28 ℃、发酵液pH值为7.2、搅拌转速为350 r·min-1、通气量分别为0.8 vvm、1.0 vvm、1.2 vvm、1.5 vvm的条件下培养7 d，考察通气量对东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素的影响，结果见表1。

表1 通气量对东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素的影响

由表1可知，随着通气量的增加，菌丝量逐渐增加，说明通气有利于菌丝生长；通气量对发酵效价影响不大；随着通气量的增加，发酵液蒸发量随之增加，放罐体积减小，发酵产量降低。考虑到通气量过大，消耗的空气量相应过多，造成能源的浪费，因此，选择东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素的最佳通气量为1.0 vvm。

2.4 溶解氧浓度对东方拟无枝酸菌发酵产万古霉素的影响

抗生素产生菌大多为异养好氧型微生物，发酵过程中对溶解氧的要求很高，发酵液中的溶解氧浓度过高或者过低都会对微生物代谢产生不良影响。当溶解氧浓度过低时，氧的同化作用不足以满足抗生素产生菌代谢活动所需的能量，限制了微生物代谢合成产物，降低了发酵效价；而溶解氧浓度过高，易引起初级代谢加快，基质迅速消耗，导致投入基质量增加，同时溶解氧浓度过高对空气量和搅拌动力造成巨大浪费。因此，控制合适的溶解氧浓度非常必要。

将培养液以5%的接种量接种至30 L发酵培养基中，通过调节搅拌转速控制最低溶解氧浓度分别为0%、10%、20%、30%，在发酵温度为28 ℃、发酵液pH值为7.2、搅拌转速为350 r·min-1、通气量为1.0 vvm的条件下培养7 d，考察溶解氧浓度对东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素的影响，结果见表2。

表2 溶解氧浓度对东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素的影响

由表2可知，当溶解氧浓度超过10%时，发酵效价明显提高；为了维持发酵过程中的高溶解氧，需要加快搅拌转速，发酵液蒸发量相应增加，放罐体积减小，发酵产量降低；菌丝量则随搅拌转速的加快逐渐增加，说明万古霉素菌丝对搅拌剪切力不敏感。综合各项指标可知，当溶解氧浓度控制在10%时，东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素的产量最高，此时搅拌转速不快，动力成本相应较低。

2.5 讨论

东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素过程中，其菌丝生长和代谢合成产物均受多种因素的影响，包括发酵温度、发酵液pH值、通气量、溶解氧浓度等。发酵过程中的最大菌丝量随发酵温度的升高而增加，但超过30 ℃时，放罐时菌丝自溶，发酵效价下降。发酵液pH值对菌丝生长影响不大，对代谢合成产物影响明显，发酵过程中效价均直线上升，pH值为7.2时发酵效价最高。较大的通气量有利于菌丝生长，对代谢合成产物无影响，但通气量增加会减小放罐体积，影响万古霉素产量。万古霉素菌丝对搅拌剪切力不敏感，发酵过程中加快搅拌转速影响了溶解氧的传递，菌丝生长加快，菌丝量增加，但同时发酵液蒸发量增加，放罐体积减小。

2.6 50 L发酵罐验证实验

通过单因素实验确定东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素的最优工艺条件为：发酵温度28 ℃、发酵液pH值7.2、通气量1.0 vvm、溶解氧浓度10%，在上述条件下，进行50 L发酵罐验证实验，连续进罐3批，发酵效价稳定，平均发酵效价达14 117 U·mL-1(表3)，平均产量达442 g，较优化前提高18.8%。

表3 50 L发酵罐验证实验结果

3 结论

采用东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素，通过单因素实验对发酵工艺进行了优化，确定最优发酵工艺为：发酵温度28 ℃、发酵液pH值7.2、通气量1.0 vvm、溶解氧浓度10%。该工艺经50 L发酵罐验证，发酵效价稳定，可用于规模化生产。