贮存时间对沼液理化性质及白三叶种子萌发的影响

刘 敬， 吴 健 ， 梁文华， 习彦花， 方 楠， 程辉彩， 康文怀

(1河北科技大学 生物科学与工程学院， 河北 石家庄 050018； 2. 河北省科学院生物研究所， 河北 石家庄 050081)

头孢菌素是目前应用最为广泛的广谱抗生素之一，头孢菌素C是头孢菌素类产品的前体，头孢菌素C发酵产生大量的抗生素菌渣，每生产1 t抗生素大约产生8～10 t湿菌渣[1]，经提取处理的菌渣仍含有少量的抗生素，直接排放污染环境破坏生态。目前企业处理抗生素菌渣所采取的技术以焚烧为主[2]，但该技术存在能耗高、严重污染环境等弊端，而厌氧消化可以有效避免该问题。菌渣厌氧发酵在将低品质的生物质能转换为清洁能源沼气的同时，可以显著降低能耗、减轻环境污染，但厌氧发酵过程会产生大量沼液，沼液安全处理是解决厌氧发酵产业链正常运行的关键问题之一。

沼液中含有丰富的氮磷钾等营养物质[3]，农用可以促进植物生长，并改善土壤环境[4-5]，减少化肥使用量。例如沼液对番茄、辣椒和水稻等作物的致病菌有明显的抑制作用[6-7]和促进早熟禾种子萌发[8]。由于厌氧发酵存在发酵周期短，进出料时间不规范等问题，造成很多营养物质无法被完全利用[9]，未完全发酵的沼液直接施入农田会对环境和植物产生损害，因此需将沼液进一步贮存使营养物质继续分解完全，从而达到合理资源化利用头孢菌素C菌渣的目的。目前对于牛粪等畜禽粪污沼液和秸秆类物质的沼液应用以及贮存过程研究较多，以头孢菌素C菌渣为原料的厌氧发酵沼液应用和贮存期间理化性质变化文献比较少，因此本研究为抗生素菌渣厌氧发酵沼液的无害化开发利用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

白三叶(Trifoliumrepens)种子：购于某种业公司；沼液：取自实验室连续运行的头孢菌素C菌渣厌氧发酵罐，水力停留时间20 d。

1.2 方法

1.2.1 沼液理化性质测定实验方法

将沼液置于2 L塑料桶中，室温、避光、密闭保存，每个月定时取一定量的沼液检测相关理化性质。将沼液贮存时间1～6个月分别编号为T1，T2，T3，T4，T5和T6。

1.2.2 沼液对白三叶种子萌发及生长的影响实验方法

选择颗粒饱满的白三叶种子并用质量分数为0.1%的KMnO4溶液消毒30 min，用去离子水清洗干净后用滤纸吸去表面水分备用。

用直径为90 mm的平板平铺3层滤纸作为发芽床，每个平板放置50粒种子，将其均匀放置。将贮存时间为1和6个月的头孢菌素C菌渣厌氧发酵沼液经过3层纱布过滤后逐步稀释，稀释倍数为0，10，20，40，60，80，100，200，300，400，500倍。以去离子水处理组作为对照，每个处理设置3个平行，在第3、7天统计种子发芽数，在白三叶种子萌发的第7天，测量其根长、芽长、鲜重、干重。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 沼液理化性质测定指标及方法

在不同贮存时间测其pH值，电导率，VFA，TIC，SCOD，总磷，氨氮等。VFA和TIC：Nordmann滴定法[10]。SCOD和氨氮：8000 rpm离心10 min后取上清，用连华试剂盒测定。全磷：钼酸铵分光光度法[11]。

1.3.2 沼液对白三叶种子萌发及生长的影响测定指标及方法

统计白三叶生长发芽势、发芽率、芽长、根长、活力指数、发芽指数。

发芽势=(发芽初期(3天内发芽种子数)/供试种子数)×100%；

发芽率=(第7天正常发芽种子数/供试种子数)×100%；

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)；

式中：Gt为处理t日的发芽数;Dt为相应的发芽天数； 活力指数=(根长+芽长)×发芽指数。

1.4 数据处理

采用spss10.0对实验进行方差分析(One-way ANOVA)，用DPS7.05进行数据差异显著性分析(Duncan法)。

2 结果与分析

2.1 贮存时间对沼液理化性质的影响

为确定贮存时间对沼液理化性质的影响，在不同贮存时间(半年内)，分别对头孢菌素C菌渣厌氧发酵沼液进行定期取样，测定其pH值，电导率，VFA/TIC，SCOD，总溶解性磷、氨氮等理化指标。

2.1.1 贮存时间对沼液pH值和电导率的影响

沼液贮存过程中pH值和电导率变化如图1所示，结果表明，pH值在7.05～8.36范围内，贮存期间pH值呈弱碱性，随着贮存时间延长，沼液的pH值和电导率均呈逐渐升高趋势；电导率主要受自由移动的离子影响，电导率范围在25.9 ～28.55 ms·cm-1，随着贮存时间延长，沼液电导率呈逐渐增加的趋势，保证植物生长的EC值应该0.2～0.6 ms·cm-1范围内[12]，远超于种子发芽最适电导率，因此沼液原液对种子发芽有很强抑制作用，不能直接使用。

图1 不同贮存时间对沼液pH值和电导率的影响

2.1.2 贮存时间对沼液VFA，TIC和SCOD的影响

SCOD(可溶性有机物)值由13560 mg·L-1降至2350 mg·L-1，降低了84.6%，说明在起始沼液中存在大量有机物，发酵不完全。在沼液贮存过程中，随着沼液中微生物对有机物的降解，SCOD水平显著下降，而在贮存第6个月时，由于大部分有机物已经降解，导致微生物活动较缓慢，从而SCOD值变化较小。如图2和图3所示。沼液在贮存0～6个月内迅速下降后趋于平缓，SCOD维持在2400 mg·L-1，也证明了发酵越完全的沼液SCOD值越低，更适用于农田作为肥料，按照国家《蔬菜灌溉水质标准》要求化学需氧量≤150 mg·L-1，因此沼液农田应用时应该稀释相应的倍数才能将其用于灌溉。

图2 不同贮存时间对沼液VFA和TIC的影响

图3 不同贮存时间对沼液SCOD的影响

随着贮存时间延长，VFA(挥发性酸)在贮存6个月含量逐渐降低，由10549 mg·L-1降至1307.5 mg·L-1，降低了87.6%，之后趋于平缓。挥发性酸是由发酵产酸菌利用小分子化合物产生，甲烷菌主要利用小分子VFA形成甲烷，在贮存0～3个月，微生物发酵导致VFA消耗较快，贮存4～6个月之间趋于平缓，这与SCOD的变化趋势类似，表明贮存过程延续了厌氧发酵，随着剩余可利用的有机物含量及VFA的进一步消耗，发酵基本结束。TIC(碳酸氢盐碱度)值显著升高后维持不变。TIC值由6400 mg·L-1增至15900 mg·L-1，增加了148.4%。而VFA/TIC是衡量厌氧发酵过程中发酵液性质稳定的一个重要指标[13]，由图2可知，在沼液贮存6个月期间系统的VFA/TIC值由1.65降至0.082，贮存末期的发酵趋于稳定。

2.1.3 贮存时间对沼液总磷、氨氮的影响

沼液中的总磷和氨氮都是保证植物生长所必要的营养元素，沼液中TP(总磷)的含量随着贮存时间的增长显著降低，TP由114.4 mg·L-1降至77.4 mg·L-1，降低了32.3%，并且在贮存初期总磷含量降低较缓慢，后期下降较快速，沼液中的氮主要是以氨态氮形式存在[14]，沼液中氨氮含量随着贮存时间的增长无显著变化，在3700 mg·L-1左右浮动(见图4)。氨氮是由含氮有机物分解产生，在体系中的分解、挥发、吸附沉淀和硝化作用以及被甲烷菌等微生物利用的过程中达到并维持动态平衡状态[15]。

图4 贮存时间对沼液总磷、氨氮的影响

2.2 贮存时间沼液对白三叶萌发和幼苗生长的影响

根据上述研究结果，由于发酵中新出的沼液有机质含量较高毒性较强，对植物影响较大，为了探究不同贮存时间对白三叶萌发的影响，分别选取了贮存时间为1和6个月的沼液，进行种子萌发试验，观察不同贮存时间对白三叶种子萌发和生长指标的影响。

2.2.1 贮存时间沼液对白三叶种子萌发参数影响

发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数是描述种子萌发以及长势的指标。由表1所示，沼液原液无法使白三叶萌发，但是随着沼液稀释倍数的增大，发芽率和发芽势在抑制解除后与对照无显著差异，沼液对发芽指数和活力指数高浓度抑制，低浓度促进。

表1 贮存时间对白三叶种子萌发的影响

T1在沼液稀释20倍以下三叶草不萌发，稀释200倍时，发芽势、发芽率和活力指数与对照无显著差异，解除抑制作用；发芽指数在稀释60倍时与对照无显著差异，并且在稀释300倍时相比对照提高了37.5%；活力指数在稀释400倍时相比对照提高了10.9%。T6在沼液稀释10倍以下三叶草基本不萌发，在沼液稀释60倍时，发芽势、发芽率和发芽指数与对照无显著差异，解除抑制作用；沼液稀释100倍时，发芽指数相比对照提高了37.4%；活力指数相比对照提高了16.4%。也表明了高浓度沼液对种子有显著的抑制作用和毒害作用，沼液稀释一定倍数后抑制作用解除，综合考虑T1在稀释300倍时效果最好，而T6在稀释100倍时效果最好，也说明了抗生素沼液贮存一定时间可以减少毒害作用，并且稀释相应倍数可以促进白三叶的萌发。

2.2.2 沼液贮存时间对白三叶幼苗生长的影响

根长、芽长、鲜重和干重是衡量幼苗生长情况的指标。由图5～图8可知，采用不同浓度沼液对幼苗生长有不同影响，沼液对根长和芽长有不同程度促进作用，沼液高浓度抑制白三叶根、芽生长，低浓度促进。T1对根长有显著的抑制作用，在沼液稀释400倍时，根长达到最长；芽长、干重和鲜重分别在沼液稀释200倍、100倍、100倍与CK相比无显著差异，芽长在稀释400倍时相比CK提高了10.7%，鲜重在稀释400倍时相比对照提高了10.6%。T6随着沼液稀释倍数的增大，出现先抑制后促进的现象，根长在沼液稀释100倍时与对照无显著差异，芽长、鲜重和干重分别在沼液稀释80倍时解除抑制，根长在稀释300倍时相比对照增加了17.1%，芽长在稀释100倍时相比对照提高了9.3%，在稀释100倍时相比对照增加了14.9%。也说明了沼液在稀释一定的倍数可以促进幼苗的生长和发育，综合考虑幼苗生长指标的影响，T1在沼液稀释400倍时幼苗生长最好，而T6在稀释100倍时幼苗生长最好。

图5 不同贮存时间对白三叶芽长的影响

图6 不同贮存时间对白三叶根长的影响

图7 不同贮存时间对白三叶鲜重的影响

图8 不同贮存时间对白三叶干重的影响

3 讨论

3.1 贮存时间对沼液理化性质的影响

目前针对沼液农用、畜禽粪污和农作物秸秆沼液贮存期间理化性质变化等方面的研究相对较多，但是对抗生素菌渣厌氧发酵沼液贮存变化特征未见相关报道。沼液中的成分较为复杂，而不同原料之间也存在很大差异，甚至同一猪场产生沼液都有很大不同[16]。本试验将沼液贮存6个月，观察理化性质的变化，表明抗生素菌渣厌氧发酵沼液贮存一定时间，pH值和电导率均呈上升趋势，这一结果与黄丹丹[17]等和对猪粪沼液贮存46天内pH值缓慢上升结论一致。pH值越大，电导率也随之增大，碱性条件有助于SCOD和溶解性蛋白质和部分磷的溶出[18]，碱性条件下电导率会增加。在沼液贮存过程中SCOD值显著降低，与张丽萍[19]等对猪粪沼液贮存维持11天化学需氧量也呈逐渐减小并趋于平稳的趋势结果相一致，其整体下降了69%以上，本试验为贮存时间0～6个月降低了84.6%，可能是由于厌氧发酵原料不同导致贮存周期变长。

总磷和氨氮作为营养物质，是植物生长所需要的必要营养元素，沼液在贮存过程中氨氮浓度相对比较稳定。此结论与刘庆玉[20]等对沼液贮存结论不同，贮存时间为30天，氨氮含量在遮光、厌氧条件下会上升，在光照、自然贮存会降低，但本试验得到氨氮与贮存时间无显著差别的结论，可能与贮存方式不同有关。总磷在贮存过程中有下降趋势，而这与李晓娟[21]对不同贮存方式贮存玉米秸秆沼液总磷下降了51%以上，而在贮存环境30℃，遮光耗氧条件下总磷含量下降最快，总磷变化一致。总磷含量下降原因可能是磷酸类物质被孔隙度较大的物质吸附，或者与其他物质发生化学反应不断沉降到沼渣中所造成，同时沼液贮存过程中受季节的环境温度不同而影响到的微生物活性，物质利用速率随之受到影响。

各项理化指标变化进一步说明在初始阶段沼液尚未发酵完全，还有大量未发酵的有机物，直接施用会对植物和土壤造成损害，需要将沼液贮存一定时间再施用。

3.2 不同贮存时间沼液对白三叶萌发和幼苗生长的影响

高浓度沼液对白三叶种子萌发和生长有显著的抑制作用，尤其沼液原液无法使白三叶萌发，随着稀释倍数的增加，抑制效果会逐渐降低，而沼液低浓度会促进白三叶种子的萌发和生长。T1在稀释200倍时白三叶萌发的各项指标与CK无显著差异，解除抑制，低浓度沼液对白三叶萌发无显著影响，但是对幼苗生长影响较大，综合各项指标其最适稀释倍数为400倍，T6在稀释60倍时白三叶萌发的各项指标基本解除抑制，而综合各项指标其最适稀释浓度为100倍，这一结果与唐才禄[22]等对沼液对生姜催芽效果在适宜浓度上有差异，可能是由于厌氧发酵原料和沼液组成不同导致的。

T6与T1相比，白三叶种子萌发和幼苗生长的各项参数解除抑制的沼液稀释倍数要低，但是随着沼液稀释倍数的增大，就会造成各项参数(除根长)都要显著低于贮存6个月的沼液，这证明了随着贮存时间的增长，沼液毒性会降低，但是营养物质也随之降低。T1根长远低于T6根长，但是芽长两者在适宜的浓度都会促进其生长，也说明了白三叶根和芽对于毒性的敏感性不同，根要比芽敏感。沼液可用于农用，但是将其直接作用于农田有一定风险[23]。将沼液贮存一段时间，贮存期间还可以将降低铜、锌和砷等重金属的含量以及大肠杆菌数量[24]，将其用于农用也会减少重金属富集和有害微生物风险，并且本试验也表明了沼液贮存一定时间，对种子毒性减小，将其利用时稀释倍数也逐渐减小。综上所述，头孢菌素C菌渣厌氧发酵沼液贮存一定时间，毒性和对植物伤害会降低，稀释到适宜的倍数，会促进白三叶种子的萌发和幼苗生长。

4 结论

(1)头孢菌素C菌渣厌氧发酵沼液随贮存时间延长，VFA和SCOD显著下降，TIC显著上升，pH值，电导率和总磷呈下降趋势，氨氮浓度相对比较稳定。

(2)高浓度沼液显著抑制种子萌发、根和芽的生长。贮存6个月的沼液，稀释60倍以上解除抑制作用，并且在适宜浓度还显著促进种子萌发、根、芽的生长。

(3)贮存1个月的沼液稀释300倍时，发芽指数达到最大，增长了37.5%，沼液稀释400倍时，活力指数、芽长和鲜重分别提高10.9%，10.7%和10.6%。贮存6个月的沼液稀释300倍时，根长达到最大，相比CK增大9.3%，沼液稀释100倍时，发芽指数、活力指数、芽长和鲜重分别提高37.4%，16.4%，9.3%，14.9%。