银耳和双孢蘑菇菌渣厌氧发酵的产气效果

李佳育, 刘诗洋, 李国建, 邹金平, 魏 萱,3

(1.福建农林大学机电工程学院；2.福建省农业信息感知技术重点实验室；3.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002)

食用菌菌渣是当前全球环境污染的重要来源之一，各国对菌渣无害化处理和产业化循环利用方面的研究都十分重视[1].近年来，中国农业产业化水平日益提升，成为世界食用菌产出大国[2].规模较大的食用菌工厂每日可产生上百吨食用菌菌渣[3]，而其中大部分以直接焚烧方法处理，不但导致资源的极大耗费，而且还会污染农业环境，加剧温室效应.因此，需要对食用菌的菌渣进行资源化利用处理.将食用菌菌渣转变为可再生能源，为工厂生产提供新能量，是延长食用菌产业链、增加食用菌生产产值、实现农业资源多级化循环利用的有效途径[4]，对农业环境保护和农村生态文明建设都有着重要意义.

厌氧发酵是指在完全缺乏溶解氧的条件下，利用兼性厌氧菌和专性厌氧菌，把有机物转变为甲烷和二氧化碳等可使用资源，是促进食用菌菌渣源头减量化、资源利用化和安全无害化的一种高效的处理技术[5].林满红等[6]对6种农业剩余物高温厌氧发酵产沼气进行研究，结果表明以杏鲍菇菌渣作为底料的产气效果最佳，茶树菇菌渣产气效果最差，不适合高温发酵制沼气；杨茜等[7]分析食用菌的菌渣与麦秸共发酵作用产气潜能，结果表明菌渣也可以作为底料进行厌氧发酵生产沼气，且不同的发酵作用温度对日产气量峰值有不同程度的影响；秦文弟等[8]测定了榆黄蘑菌渣的产沼气潜力，结果表明菌渣为厌氧发酵产生沼气的原材料，且温度为影响菌渣产气量和产气率的关键因素.

厌氧发酵产气潜能与发酵底料中有机物的种类与含量有关，不同含量营养成分对产甲烷菌的生长代谢有重要影响[9].本研究通过分析银耳和双孢蘑菇两种食用菌菌渣的主要营养成分含量，采用正交试验设计方法对不同发酵温度、不同接种物含量下厌氧发酵产沼气过程中的日产气量、pH值以及甲烷含量等重要参数的变化规律进行分析，进一步探索这两种食用菌菌渣厌氧发酵的最佳条件，为厌氧发酵反应器的仿真模拟设计提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：福建祥云银耳生产有限公司提供的杂木屑和麦麸的银耳菌渣；福建农科院食用菌研究中心提供的含有麦秸和鸡粪的双孢蘑菇菌渣.将原料中大木屑、秸秆等颗粒物去除后装在密封袋中，储存于-20 ℃冰柜中.试验开始前，将冰冻的原料置于4 ℃冰箱中缓冻.

接种物沼液的有效菌种类型为产甲烷杆菌(Methanogenus)，其中有效活菌数≥2.0×108个·mL-1.沼液保存于避光黑瓶中，储存在阴凉、干燥、通风的环境中备用.

1.2 试验装置

采用发酵容量为2 L的厌氧发酵瓶，有效料液容积为1.5 L.利用硅胶管与铝箔集气袋连接，形成厌氧发酵试验装置.试验仪器设备包括恒温定时水浴锅(BHS-4，宁波群安实验仪器有限公司产品，恒温分辨率0.1 ℃)、电子天平(JJ124BF，常熟双杰测试仪器厂产品)和气相色谱仪(7890B，美国Agilent公司产品)等.试验装置结构如图1所示.

1.恒温定时水浴加热装置;2.厌氧发酵瓶;3.开关a;4.开关b;5.铝箔集气袋.图1 试验装置结构图Fig.1 Structure diagram of test device

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理 将碾碎后的食用菌菌渣称重后以每份300 g依次装入3个发酵瓶内，再接种沼液250、500、750 mL，最后加水补足，保证发酵作用体系总容积为1 L.然后置于30、40、50 ℃的恒温水浴锅中进行厌氧发酵反应，总发酵时间为14 d.

1.3.2 主要营养成分的测定 淀粉含量的测定：首先利用80%(体积分数)乙醇将试样中的可溶性葡萄糖和淀粉分离，然后采用酸水解法将淀粉分解为葡萄糖，再采用蒽酮比色法测得葡萄糖含量，计算淀粉含量[10].

粗脂肪含量的测定：采用乙醚抽提残余法[11].

粗蛋白含量的测定：采用凯氏定氮法，粗蛋白含量=总氮含量×6.25[12].

木质素含量的测定：采用可见分光光度法，在木质素中的酚羟基发生乙酰化后于280 nm处有特征吸收峰，而280 nm 的光密度与木质素含量成正相关[13].

纤维素含量的测定：采用可见分光光度法.纤维素是由β-葡萄糖残基所组成的多糖，在酸性条件下受热后分解成β-葡萄糖.β-葡萄糖在强酸作用下脱水生成β-糠醛类化合物.β-糠醛类化合物与蒽酮脱水缩合，最后形成糠醛衍生物，其颜色的深浅可间接反映纤维素含量[14].

1.3.3 厌氧发酵产气的测定 每日用针筒在固定时间内取出1 mL发酵液，测定发酵体系中的pH值，最后取平均值.重复3次.同时，收集铝箔集气袋中的气体进行测定，采用描述统计方法中的均值法得到菌渣的日产气量.再将日产气量计算转化为单位原料的日产气量，比较两种菌渣发酵效果，重复测定3次，求得平均值后作图.

1.3.4 甲烷含量的测定 采用正交试验方法[15]对气相色谱仪收集到的气体测定甲烷含量.不同发酵温度的产气特性不相同[16]，故将试验组发酵温度设为30～50 ℃.不同接种物含量对反应启动速率影响显著，且其产气特性与物料含量互相制约[17]，所以将试验组接种物含量设为25%～75%.正交试验设计的因素水平和编码见表1，食用菌菌渣种类仅有二水平.正交试验设计方案如表2所示.

表1 正交试验设计的因素水平和编码Table 1 Factor level and coding of orthogonal experiment design

表2 正交试验设计方案Table 2 Orthogonal design scheme

2 结果与分析

2.1 主要营养成分含量

对银耳菌渣和双孢蘑菇菌渣的主要营养成分含量进行测定，从表3可知，二者的粗脂肪、淀粉、木质素含量无显著差异，纤维素含量有显著差异，而粗蛋白含量有极显著差异.双孢蘑菇菌渣的粗蛋白含量和淀粉含量都高于银耳菌渣，但粗脂肪、木质素和纤维素的含量低于银耳菌渣.表明两种食用菌菌渣的主要营养成分含量都较高，可将它们作为厌氧发酵原料.

表3 银耳菌渣和双孢蘑菇菌渣的主要营养成分含量1)Table 3 Main nutrient contents of T. fuciformis residue and A. bisporus residue %

2.2 银耳菌渣和双孢蘑菇菌渣的沼气发酵效果

2.2.1 日产气量 由图2可知，在不同厌氧发酵条件下，两种菌渣试验组的产气反应均能正常发生，但两者的日产气量差别较大.发酵温度相同时，接种物含量会影响菌渣的日产气量；接种物含量相同时，发酵温度对日产气量的峰值有一定影响.而双孢蘑菇菌渣无论在何种发酵条件下，其日产气量总高于银耳菌渣，这与不同种类菌渣主要营养成分含量有关.

图2a为发酵温度设置成30 ℃时的日产气量变化折线.从图2a可以发现，25%、50%、75%接种物含量的银耳菌渣日产气量分别在第5天、第3天、第3天出现峰值，峰值分别为4.0、5.0、5.6 mL·g-1.25%、50%、75%接种物含量的双孢蘑菇菌渣日产气量分别在第6天、第5天、第3天出现峰值，峰值分别为23.0、25.0、27.0 mL·g-1.同时，图中75%接种物含量的两种菌渣试验组反应启动速度都较快，在高峰期后仍保持较高日产气量；而25 %接种物含量的试验组相对滞后.因此同种类菌渣在发酵温度相同时，随着接种物含量的提高，反应启动速度加快且日产气量提高.从图2可知，接种物含量为75 %的银耳菌渣，在发酵温度为30、40和50 ℃时，其日产气量峰值分别在第3天、第3天、第2天出现，峰值分别为5.6、7.5、8.8 mL·g-1.相同发酵条件的双孢蘑菇菌渣试验组，其日产气量峰值分别出现在第3天、第3天、第2天，峰值分别为27.0、32.0、52.0 mL·g-1.由此可知，发酵温度升高不仅能提高产气反应速率，还能够在一定程度上增加日产气量.

a.发酵温度为30 ℃；b.发酵温度为40 ℃；c.发酵温度为50 ℃；Y1.25%接种物的银耳菌渣；Y2.50%接种物的银耳菌渣；Y3.75%接种物的银耳菌渣；S1：25%接种物的双孢蘑菇菌渣；S2.50%接种物的双孢蘑菇菌渣；S3.75%接种物的双孢蘑菇菌渣.图2 两种食用菌菌渣在不同发酵条件下的日产气量变化Fig.2 Variation of daily gas production of 2 kinds of edible fungi residues under different fermentation conditions

2.2.2 pH值的变化 银耳菌渣和双孢蘑菇菌渣在50 ℃发酵温度下不同接种物含量发酵液的pH值随时间的变化趋势如图3所示.由图3可知，两种菌渣发酵液的pH值在0～5 d有明显差别，在6～14 d的变化趋势基本相同.但与双孢蘑菇菌渣试验组相比银耳菌渣试验组的起始pH值都较小(7.1～7.3).25%、50%和75%接种物含量发酵液的pH值分别在第4天、第3天、第2天达到最小值(分别为6.5、6.6和6.7)，随后都逐渐缓慢回升；分别在第8天、第7天和第6天后基本维持稳定.双孢蘑菇菌渣的发酵液起始pH值为7.4～7.6，且反应过程中下降速度快；25%、50%和75%接种物含量的pH值分别在第3天、第2天、第2天达到最小值(分别为6.7、6.9和7.1)；并分别在第6天、第5天、第4天开始维持稳定.表明两种菌渣发酵液的pH值都随着接种物含量的升高而小幅增加.当接种物含量过低时，体系内甲烷菌数量不足，从而影响体系内的反应速度.而两种菌渣反应体系内pH值为6.5～7.7，产甲烷菌在体系中都可正常生长.

Y1.25%接种物的银耳菌渣；Y2.50%接种物的银耳菌渣；Y3.75%接种物的银耳菌渣；S1.25%接种物的双孢蘑菇菌渣；S2.50%接种物的双孢蘑菇菌渣；S3.75%接种物的双孢蘑菇菌渣.图3 两种菌渣在50 ℃发酵温度下发酵液pH值变化情况Fig.3 Variation of pH value of fermentation broths of 2 kinds of fungi residues fermented under 50 ℃

2.2.3 甲烷含量 甲烷含量数值的极差分析如表4所示.对于A-1、A0、A1来说，3个试验组的试验条件都是完全相同的，可直接对比.而kA-1、kA0的数值都不相等，说明因素A(食用菌菌渣种类)的水平改变对试验结果有影响.同理可得因素B(发酵温度)、因素C(接种物含量)的水平改变也对试验结果有一定影响.因kA0>kA-1，所以因素A的优水平为A0(双孢蘑菇菌渣)；同理可得，因素B的优水平为B1(50 ℃)，因素C的优水平为C0(50%).因RA>RC>RB，故食用菌菌渣种类对试验指标的影响最大，其次是接种物含量，最后是发酵温度.结果表明该试验最优组合为A0B1C0，即双孢蘑菇菌渣在发酵温度为50 ℃且接种物含量为50%时，其甲烷含量最高，产气质量最优.

表4 正交试验极差分析 Table 4 Range analysis of orthogonal test

3 讨论

食用菌菌渣作为一种高木质纤维素的发酵原料，其木质纤维素较难溶解，故产气性能要依据淀粉、脂肪以及蛋白质的含量而定[18].本研究通过对比两种食用菌菌渣的主要营养成分含量，结果表明二者的木质素及纤维素含量均高于粗脂肪、粗蛋白和淀粉含量.这是因为培养基中的主要营养成分在食用菌生长过程中被吸收利用，菌渣中的木质素及纤维素含量会明显升高.林满红等的研究[6]结果中银耳菌渣的粗蛋白和粗脂肪含量均高于本研究，这是因为本研究中培养基原料为杂木屑和麦麸，而银耳作为木腐类食用菌，其菌丝几乎没有分解纤维素的能力，在子实体生长过程中必须依赖另一种真菌的协助，且不同生长过程和出菇状况对菌渣主要营养成分含量也有影响.

表5 正交试验方差分析1) Table 5 Variance analysis of orthogonal test

在厌氧发酵过程中，原料的主要营养成分含量和产气潜能之间具有必然的关联[19].原料中脂类的产气量最多，其甲烷含量也高；蛋白质的产气量虽少，但其甲烷含量高；碳水化合物的产气量少且甲烷含量较低[20-21].通过将两种菌渣试验组在不同发酵温度和接种物含量条件下进行产气测定试验，结果表明双孢蘑菇菌渣的日产气量、甲烷含量均高于银耳菌渣.这与二者的主要营养成分含量不同有关，双孢蘑菇菌渣的木质素、纤维素含量低，在反应过程中更有利于微生物的分解.因此以食用菌菌渣作为厌氧发酵原料时，其淀粉、蛋白质、脂肪含量越高，木质纤维素含量越低，产气潜能及质量也越好.

pH值是影响农业剩余物厌氧发酵产生沼气的关键因素之一[22]，产甲烷菌最适合的pH值为6.5～7.8[23].pH值可以反映产甲烷菌是否在反应系统中正常生长繁殖.本研究对菌渣发酵液pH值进行测定，结果表明银耳菌渣的初始pH值较双孢蘑菇菌渣小，不利于产甲烷菌的生长和代谢，导致反应体系内产生酸化现象；25%接种物的银耳菌渣因为产甲烷菌的菌量不足，产酸与产甲烷的速率降低，体系内挥发酸大量积累，使pH值迅速降低，厌氧发酵反应终止，其产气量小且质量差.

厌氧发酵体系中发酵温度和接种物含量与反应速度、菌体生长速度以及物质合成速度等有密切联系，在一定温度范围内，温度越高，产气速度也越快；10%～30%的接种物含量最适宜发酵[24-25].本研究结果表明食用菌菌渣种类对甲烷含量的影响最大，其次是接种物含量，对发酵温度的影响最小；两种菌渣的日产气量都随着发酵温度的升高而增大，且产气速度明显提高；两种菌渣在25%接种物含量时，都因为接种物含量不足，反应启动过慢，且产气速度低下；而75%接种物含量时，过高的接种物含量使得反应体系中主要营养成分含量低，虽然产气量大但质量低，与50%接种物含量试验组相比其甲烷含量并未明显升高.

4 小结

对比两种食用菌菌渣厌氧发酵的产气效果，结果表明：双孢蘑菇菌渣的产气效果显著好于银耳菌渣；厌氧发酵原料的淀粉、粗脂肪、粗蛋白含量越高，木质素和纤维素含量越低，产气效果越好.而且，发酵体系中随着发酵温度的升高，菌渣的日产气量有明显增加；随着接种物含量的增加，其日产气量也有小幅度增加.但根据两种菌渣产气甲烷含量的测定试验，发现日产气量多并不意味着其甲烷含量高，这与其体系内的主要营养物质含量有关.当双孢蘑菇菌渣在发酵温度为50 ℃、接种物含量为50%时，其产气效果最好，总产气量较多且质量高；而银耳菌渣的产气效果不佳，不适合作为厌氧发酵底料来制备沼气.