响应面法优化三氯化铁回收河鲀鱼糜漂洗液中蛋白质的研究

刘淑集，黄珊红，陈晓婷，陈 贝，许 旻，苏永昌，刘智禹*

[1.福建省水产研究所，国家海水鱼类加工技术研发分中心(厦门)，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建 厦门 361013；2.厦门海洋职业技术学院，福建 厦门 361100]

将鱼经过采肉、漂洗、精滤、脱水搅拌及冻结加工得到鱼糜[1]，再将鱼糜经过擂溃(斩拌)、成型、加热和冷却工序制成鱼糜制品[2]。漂洗是鱼糜加工过程中的关键工艺[3]，但鱼糜在经过漂洗的过程中会产生废液，漂洗废液直接排放会导致水质受到严重污染。而且鱼肉中30%～40%蛋白质以不溶性的鱼糜微粒和水溶性的形式存在于鱼糜漂洗液中，随着漂洗液的丢弃而流失，造成了蛋白质的浪费。经研究表明，鱼糜漂洗液回收蛋白质中氨基酸种类齐全，并且比例均衡，符合FAO/WHO推荐的理想蛋白质模式，是理想的优质蛋白质[4]。回收这部分的鱼糜漂洗液不仅能减少环境污染，降低废水处理费用，还能在很大程度上增加企业潜在的利润。因此，如何回收鱼糜漂洗液中的水溶性蛋白质成为人们关注的焦点。回收鱼糜漂洗液的方法主要有絮凝法[5]、超滤法、等电点沉淀法[6]和离子交换法[7]等。但这些方法各有利弊，无法同时满足回收率、操作简便、成本低廉等要求。

三氯化铁(FeCl3)是一种蛋白质絮凝剂，可使蛋白质聚沉而进行回收。它易溶于水，具有絮凝速度快、安全无毒、成本低等优点，已被广泛应用于食品、造纸、化工、煤矿、环境保护等领域中的废水处理[8]。孙红杰等[9]采用8 mg/mL的FeCl3絮凝地下水，发现当pH>6时，主要絮凝机理是以氢氧化铁[Fe(OH)3]的网捕卷扫为主；当pH<4时，主要絮凝机理是Fe3+以压缩双电层为主。因此，本研究拟开展FeCl3法回收鱼糜漂洗液中蛋白质工艺的研究与优化，以期应用于鱼糜加工过程中漂洗液废水的处理，回收蛋白质，变废为宝，提高鱼糜加工的附加值。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及设备

试验材料：河鲀，购自福建省鲀之鲜水产有限公司。鱼糜漂洗液：将河鲀鱼肉进行斩拌2 min；水的温度保持在10℃，水和鱼糜的比例为7∶1，配好水和鱼糜的比例后开始进行漂洗，分3次漂洗，一次3 min；漂洗后静置3 min以上，倒出漂洗液，储存。

试验试剂：三氯化铁(FeCl3)，购自国药集团化学试剂有限公司；Pierce BCA Protein Assay Kit BCA蛋白质含量检测试剂盒，购自美国Thermofisher公司。

试验仪器：pH计、斩拌机、恒温水浴锅、台式离心机、恒温振荡器、M200PRO酶标仪。

1.2 试验方法

工艺流程：在10 mL鱼糜漂洗液中加入一定量的FeCl3溶液，调节一定的pH，放置在一定温度的水浴锅保温一定时间，4 000 r/min离心10 min。取上清液25 μL和BCA试剂200 μL混合于酶标板上，放置在37℃恒温振荡器震荡30 min。通过酶标仪测定562 nm的OD值，绘制标准曲线，计算蛋白质含量。

1.2.1 单因素试验法

以蛋白质回收率(Rate of protein recovery，RPR)为指标，在固定其他影响因素保持不变的状态下，分别考察1% FeCl3溶液添加量(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL)、pH(3、5、7、9、11)、回收温度(25、45、55、65、75℃)、回收时间(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h)对蛋白质回收效果的影响，每个水平试验重复3次。

1.2.2 蛋白质回收率的测定

蛋白质回收率=[1-(絮凝后上清液中蛋白质含量/鱼糜漂洗液原液中蛋白质含量)]×100%

1.2.3 响应面优化FeCl3法回收蛋白质的工艺条件

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Benhnken中心组合设计原理[10]，选取pH(X1)、回收温度(Temperature，T)(X2)与1% FeCl3溶液添加量(Addition of 1% FeCl3solution，AFS)(X3)3个因素作为自变量，以蛋白质回收率(Y)作为响应值，在pH(3、5、7)、回收温度时间(60、65、70℃)和1% FeCl3溶液用量(1.0、1.5、2.0 mL)3因素3水平上对FeCl3法回收蛋白质进行响应面优化，并进行验证。

1.3 数据分析处理

2 结果与分析

2.1 各单因素对FeCl3法回收蛋白质的影响

2.1.1 FeCl3溶液添加量对蛋白质回收率的影响

FeCl3溶液添加量对回收鱼糜漂洗液中的蛋白质有明显的影响，结果见图1。在pH 7、回收温度55℃和回收时间3 h的条件下，随着FeCl3溶液添加量的增加，蛋白质回收率随之快速增加，这是由于Fe(OH)3的吸附作用引起的。所以，当漂洗液中蛋白质浓度较高时，需要的FeCl3浓度相对较高，说明FeCl3的用量和漂洗液蛋白质的浓度存在一定的正相关关系[11]。当1% FeCl3溶液添加量超过1.5 mL时，蛋白质回收率增加的趋势变慢，因此，选择FeCl3溶液的添加量为1.5 mL，此时蛋白质回收率为75.33%。

2.1.2 pH对蛋白质回收率的影响

pH对鱼糜漂洗液中蛋白质回收效果的影响如图2所示。在回收温度55℃、回收时间3 h和1% FeCl3溶液添加量为1.5 mL的条件下，随着pH的增加，漂洗液中蛋白质的回收率越来越高，当pH为5时，回收率最高，为58.29%。之后随着pH的升高，蛋白质的回收率逐渐下降。在弱酸性范围内，随着pH的升高，水解作用增强。当pH达到5～6时，Fe3+转化为Fe(OH)3胶体，该胶体具有较强的吸附架桥和吸附电中和功能，使蛋白质能够得到最大程度的凝聚。但继续增大pH，絮凝作用减弱，导致蛋白质回收率下降[12]。因此，选择pH 5作为后续优化的条件。

2.1.3 回收温度对蛋白质回收率的影响

回收温度对FeCl3法回收鱼糜漂洗液中的蛋白质有明显的影响，结果如图3所示，在pH 7、回收时间3 h和1% FeCl3溶液添加量为1.5%的条件下，随着回收温度的升高，蛋白质回收率逐渐增高。当温度达65℃时，蛋白质的回收率最高，为88.39%。当继续提高温度，蛋白质回收率反而下降，这可能是因为高温使蛋白质失去活性，造成蛋白质脱附，导致回收率下降[13-14]。因此，回收温度选择65℃为宜。

2.1.4 回收时间对蛋白质回收率的影响

在pH 7、回收温度55℃和1% FeCl3溶液添加量为1.5 mL的条件下，回收时间对FeCl3回收鱼糜漂洗液中的蛋白质的影响较小，结果如图4所示。Fe3+在很短的时间内能够转化为Fe(OH)3胶体。回收1 h时蛋白质的回收率达60.22%，4 h 时回收率增加到61.99%，增加缓慢，此后继续延长时间，蛋白质回收率几乎呈稳定状态。所以选取的回收时间为4 h。

2.2 响应面试验结果

对各单因素数据进行组间的显著性分析[15]发现，pH、回收温度、1%FeCl3溶液添加量和回收时间4个因素在设定的水平之间的限制差异P值分别0、0、0、0.452，其中回收时间对蛋白质回收率没有显著影响，所以选择pH(pH/X1)、回收温度(T/X2)和1%FeCl3溶液添加量(AFS/X3)为自变量，以蛋白质回收率(RPR/Y)为因变量，应用Design-Expert 8.0软件，进行3因素3水平的鱼糜漂洗液回收工艺优化，试验结果如表1所示。

表1 响应面试验设计方案与结果

从表1的试验数据，可以看出在不同pH、回收温度和1%FeCl3溶液添加量的影响下，蛋白质回收率各不相同。1%FeCl3溶液添加量在1.5～2.0 mL、回收温度在60～65℃、pH在5～7时，蛋白质回收率达到最高值。

根据Box Behnken试验设计进行了17组试验，得到二次多项式拟合方程为：

Y=93.21+9.40X1+1.37X2-3.39X3+1.62X1X2+5.51X1X3-0.33X2X3-8.71X12-12.39X22-10.64X32。

根据二次模型的方差分析结果(表2)，Y方程回归模型的P值为0.035 2(<0.05)，说明模型达到显著水平，失拟项P值为0.055 4，失拟不显著，说明方程拟合良好，回归方程式具有可靠性。

表2 蛋白质回收率二次回归方程方差分析结果

续表2

由表1和表2可以看出，各响应因素影响程度：X1>X3>X2，即回收时pH对蛋白质的回收率影响最大。

3个因素对蛋白质回收率影响交互作用的响应面结果如图5所示。随着pH、温度和1%FeCl3溶液添加量的增加，蛋白质的回收率先升高后下降，3个因素的两两交互曲面整体呈现凸起，为倒“U”形，等高线呈椭圆形，说明3个因素两两间存在一定的交互作用。

利用Design-Expert 8.0软件对响应面结果进行最优化分析，以蛋白回收率为评价指标，确定回收鱼糜漂洗液的最优工艺为温度65.44℃、pH 5.94、1% FeCl3溶液添加量1.37 mL，此时蛋白回收率达到最大值，为(96.47±0.953)%。为操作便利，将此条件调整为温度65℃、pH 6、1% FeCl3添加量1.4 mL，并进行3次重复试验，计算蛋白质的回收率为95.14%，与模型预测值没有显著性差异，说明响应面法得到的回归模型具有一定的可靠性。

3 结论

在单因素试验的基础上，得出的试验结果是在pH为5～6、温度为55～65℃、1%FeCl3溶液添加量为1.5～2.0 mL时，蛋白质回收率较高，达88.49%。通过响应面法进行数值优化，得到试验结果为10 mL鱼糜漂洗液在温度65℃、pH 6、1% FeCl3溶液添加量为1.4 mL时，蛋白回收率达到95.14%。获得的FeCl3法回收鱼糜漂洗液中的蛋白质优化工艺，可进行放大并被应用于鱼糜生产企业；回收的蛋白质可作为蛋白质补充剂添加在鱼粉、饲料中，有助于企业充分利用鱼糜漂洗液的蛋白质，提高鱼糜加工的附加值，减少排放漂洗液带来的环境污染，降低污水处理成本，具有一定的经济效益。