发酵条件对苹果酵素品质及生物活性的影响

张海燕，康三江，张芳，张霁红，宋娟

1.甘肃省农业科学院农产品贮藏加工研究所（兰州 730070）；2.甘肃省果蔬贮藏加工技术创新中心（兰州 730070）

食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物为主要原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分可供人来食用的酵素产品[1-2]。其在含有植物本身的多种维生素、酶和矿物质等营养物质的同时，还通过微生物发酵产生新的次生代谢物及活性成分，与直接食用蔬菜水果相比，酵素中的生物活性成分和有机小分子更为浓缩，而且更容易为人体所吸收，这正是酵素的魅力所在，也是研究热点。大量研究表明，这些物质从细胞层面调节机体的生命活动，具有抗氧化[3-5]、降血脂及减肥[6-7]、提高免疫力[8-9]、解酒与护肝[10]、抑菌[11]、改善肠胃功能[12-13]等功效。但是，由于目前许多酵素的生产工艺不规范，发酵过程控制不科学，使得产品的代谢通路以及代谢终产物难以确定，同时各类酵素产品成分复杂，作用机理尚不明确。因此，食用酵素的生产工艺以及产品质量控制都有待进一步的发展与研究。

苹果因其优良的感官特性和糖类、蛋白质、有机酸、维生素及苹果多酚等丰富的营养成分而成为全球最受欢迎的水果之一[14]，具有抗氧化、延缓衰老和增强免疫力等功效[15]。目前，苹果对健康的影响主要归因于其酚类化合物含量高，酚类物质在抑制肿瘤、防止冠心病等方面具有很高的生理活性[16]。自然发酵体系是酵素食品开发应用的基础和微生物多样性研究的重要来源[17]，该技术作为酵素产品制作工艺的重要环节之一，可产生多种酶、短链脂肪酸、醇、酯等次级代谢产物，亦可能将原料的某些成分转化成高活性物质，因而产品的风味比较特殊[18]。李飞等[19]和杨小幸等[20]研究了天然发酵过程中苹果酵素的抗氧化活性和代谢产物的变化，但有关发酵条件对自然发酵苹果酵素品质及生物活性的影响尚未见报道。因此，选择以苹果为原料，以品质、功效酶和抗氧化能力等相关指标为衡量标准，研究初始pH、糖添加量、料液比等发酵条件对自然发酵苹果酵素品质及生物活性的影响，以期为苹果酵素产品质量控制和指导生产实践提供部分理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

富士苹果采自甘肃省庆阳市有机苹果基地；果糖、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、盐酸、氢氧化钠、酚酞、DPPH、乙醇、ABTS、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯化铁、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、Tris、邻苯三酚、淀粉酶试剂盒、盐酸、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、聚乙烯醇、橄榄油、磷酸二氢钾、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠、葡萄糖、羧甲基纤维素钠、无水硫酸钠、酒石酸钠、苯酚、3, 5-二硝基水杨酸等试剂由中瑞化学试剂公司提供，所用试剂均为分析纯。

UV-1100型紫外可见分光光度计，上海凌析达仪器有限公司；LRH-70型恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；YXQ-LS-75G型立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DK-S24数显恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；MIRCOCL 17R离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；超低温冰箱，青岛海尔集团；DL-CJ-1N超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；PB-10型精密pH计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 苹果酵素制备

操作要点：新鲜苹果清洗、沥干水分后去皮、去核并切分成3～5 mm的片，将苹果片与纯净水按质量比加入无菌酵素发酵罐中，调节糖度及pH，在常温（20～26 ℃）下自然发酵3个月，发酵结束过滤分离得到苹果酵素产品，取样进行指标测定，重复3次，取平均值。

1.2.2 品质指标的测定

pH采用pH计法测定；可溶性固形物含量采用糖度计法测定；总酸的测定参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》方法。

感官指标的测定依据GB/T 16291.1—2012《感官分析选拔、培训与管理评价员一般导则第1部分：优选评价员》要求，筛选出6名评价员组成感官评价小组，对其进行苹果酵素的感官评价培训，并根据QB/T 5323—2018《植物酵素》中食用植物酵素的规定对苹果酵素的色泽、组织形态、滋味、气味、杂质等应用9点标度法[21]进行感官评价，见表1。评价时采用3位数字随机编码保证样品提供的一致性，以随机的顺序提供，评价小组3次重复后的平均分为指标定量结果。

表1 苹果酵素感官评价描述词标度

1.2.4 抗氧化能力的测定

DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力、羟基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、还原力的测定参考樊秋元[22]的方法。

1.3 统计学处理

每组试验重复3次，试验数据采用Excel 2010、SPSS 22.0数据分析软件进行分析处理及作图。

2 结果与分析

2.1 发酵条件对苹果酵素品质的影响

2.1.1 初始pH对苹果酵素品质的影响

pH、可溶性固形物、总酸等是衡量酵素发酵成熟的主要指标，感官评价也是反应酵素品质的重要指标。由图1可以看出，随着初始pH的升高，苹果酵素产品的pH和可溶性固形物含量均呈先降低后升高趋势，其中pH 4.5时最低，分别为3.06和3.4 °Brix；总酸含量和感官评价则呈反向趋势，先升高后降低，pH 4.5时达到峰值，分别为2.91 g/L和7.41。说明pH 4.5的发酵环境适合苹果酵素自然发酵微生物快速繁殖和生长代谢，有利于提高产品的品质。

图1 初始pH对苹果酵素品质的影响

2.1.2 糖添加量对苹果酵素品质的影响

如图2所示，发酵液中不添加糖时，苹果酵素产品的pH较高，为3.55，可溶性固形物和总酸含量均较低，分别为3.4 °Brix和0.82 g/L，随着糖添加量的增加，pH呈先降低后升高的趋势，糖添加量15%时最低，为3.03；可溶性固形物则随着糖添加量的增加而逐渐升高；总酸和感官评价的变化趋势为先升高后降低，糖添加量15%时达到最大值3.24 g/L和7.29。说明发酵液中糖添加量过高或过低，都可能严重影响微生物的生长和产物的合成，发酵进程不能顺利进行，产品品质受到影响。

图2 糖添加量对苹果酵素品质的影响

2.1.3 料液比值对苹果酵素品质的影响

由图3可知，不同料液比值对苹果酵素的pH、可溶性固形物、总酸、感官评价、还原力和SOD活性均有不同程度的影响。如图3所示，料液比值在100～200 g/L时，pH、可溶性固形物呈下降趋势，料液比值在200 g/L时最低，分别为3.06和4.2 °Brix，之后随着料液比的增加逐渐上升；而总酸和感官评价的变化趋势正好相反，在料液比值为200 g/L时达到最大值3.99 g/L和7.6。说明只有在适宜的料液比下苹果酵素才能发酵完全，保证产品品质。

图3 料液比值对苹果酵素品质的影响

2.2 发酵条件对苹果酵素生物活性的影响

2.2.1 初始pH对苹果酵素生物活性的影响

如图4所示，苹果酵素中存在SOD、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等功效酶，且5种酶的活性均随着初始pH的升高呈先升高后降低趋势，其中SOD和纤维素酶的含量较高，pH 4.5时分别达到最大值41.54和27.34 U/mL，蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的含量较低，pH 4.5时达到最大值，分别为8.09，5.08和2.15 U/mL，均高于pH 4.0和pH 5.0条件下发酵的；初始pH对各自由基清除率和还原力的影响趋势与功效酶的变化趋势一致，pH 4.5时，DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率、ABTS自由基清除率和还原力达到最大值，分别为78.29%，65.06%，71.01%，68.28%和1.84（OD700nm值），说明适宜的pH有利于苹果酵素发酵过程生物活性物质的合成，表现出较强的酶活性和自由基清除能力。

图4 初始pH对苹果酵素生物活性的影响

2.2.2 糖添加量对苹果酵素生物活性的影响

图5中，SOD、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等功效酶的活性以及DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基、ABTS自由基等清除能力的变化在0～15%之间呈上升趋势，当糖添加量为15%时达到最大值，5种酶分别为33.12，22.75，9.22，5.15和0.14 U/mL，4种自由基清除率分别为83.17%，65.08%，79.03%和52.01%，之后随着糖添加量增加逐渐下降；而还原力则随着糖添加量的增加而一直增大，这可能与发酵液中还原糖的增加有关，与肖梦月等[23]的研究结果一致。说明发酵液中糖添加量过高或过低，都可能严重影响微生物的生长和产物的合成，进而影响苹果酵素中各种酶的活性和自由基清除能力。

图5 糖添加量对苹果酵素生物活性的影响

2.2.3 料液比值对苹果酵素生物活性的影响

由图6可知，不同料液比值对苹果酵素的SOD、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等功效酶的活性、DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基、ABTS自由基等清除能力以及还原力均有不同程度的影响，随着料液比的增加呈先升高后降低趋势，当料液比值为200 g/L时达到最大值，5种酶分别为32.28，25.15，10.18，6.10和1.19 U/mL，4种自由基清除率分别为82.51%，68.45%，77.26%和62.69%，还原力为2.18（OD700nm值）。说明只有在适宜的料液比值下苹果酵素的酶活性和自由基清除能力才会更强。

图6 料液比值对苹果酵素生物活性的影响

3 结论与讨论

食用植物酵素作为一种功能性微生物发酵制品因其丰富的营养和显著的功效多年来盛行于欧美、东南亚、日本以及中国台湾地区，受到国内外学者的普遍关注[24]。酵素发酵技术通过复杂的物质代谢，不仅可以改善果蔬原料原有的一些不良风味，还可以产生一些新的生物活性成分，增加酵素食品的风味、口感及功效，提高产品品质[25]。目前有关酵素的抗氧化性能的研究较多，陈爽等[26]和张梦梅等[27]研究发现，酵素产品通过有益微生物的发酵，超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等功效酶均有一定活力和较好的抗氧化能力，且酵素富含的多酚、黄酮以及功效酶等物质能够有效清除机体内自由基[28]。研究中，苹果酵素中存在SOD、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等有活力的功效酶，且产品具有一定的清除DPPH、超氧阴离子、羟基、ABTS等自由基的能力。

适宜的发酵条件是保证酵素产品品质和功效的关键[29]。pH是微生物代谢的综合反映，影响发酵产品微生物的生长和产物的合成，pH过高或过低均会抑制微生物的生长以及酶的活性，适宜的初始pH有利于提高碳水化合物的利用率，使得发酵液中可溶性固形物降低，同时可能由于发酵过程中乳酸、乙酸、苹果酸等有机酸含量增加，引起总酸含量增加，产品的pH随之降低[30]，因此，苹果酵素发酵液的初始pH是十分重要的参数。研究表明，初始pH 4.5时，产品发酵完全，pH和可溶性固形物最低，分别为3.06和3.4 °Brix；总酸含量和感官评价最高，分别为2.91 g/L和7.41；SOD、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等功效酶的活力最好，分别为41.54，27.34，8.09，5.08和2.15 U/mL，清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基、ABTS自由基的能力以及还原力最高，分别为78.29%，65.06%，71.01%，68.28%和1.84（OD700nm值），说明pH 4.5的发酵环境适合苹果酵素自然发酵微生物快速繁殖和生长代谢，保证了产品的品质和酶活性，进而影响自由基的清除能力，这与朱德艳[31]的研究结果一致。碳水化合物是微生物生长的重要影响因子，微生物通过消耗碳水化合物完成生长代谢的过程[32]。研究中，当糖添加量15%时，pH下降最快，为3.03，总酸和感官评价最高，分别为3.24 g/L和7.29；SOD、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等5种功效酶的活力分别为33.12，22.75，9.22，5.15和0.14 U/mL，DPPH、超氧阴离子、羟基、ABTS等4种自由基清除率分别为83.17%，65.08%，79.03%和52.01%，这是因为糖添加量过低，发酵不完全，产物少，产品品质及生物活性较低；糖添加量过高，发酵液的渗透压增加，微生物正常生长代谢受到抑制，发酵进程不能顺利进行，pH下降受阻，总酸、感官评价等品质指标及生物活性均受到影响。加水会降低发酵体系中的糖浓度而降低高渗透压，并升高发酵液pH，降低二者对微生物生长和发酵的影响，但只有在适宜的料液比下食用酵素才能发酵完全，保证产品品质，继续增加加水量，会使发酵体系中糖浓度过低，pH过高，不利于发酵，因此，适宜的料液比值也是微生物酵素发酵成功的重要因素[33]。研究采用的料液比中，当料液比值在200 g/L时，产品的pH和可溶性固形物最低，分别为3.06和4.2 °Brix，总酸和感官评价达到最大值3.99 g/L和7.6；5种酶活力最好，分别为32.28，25.15，10.18，6.10和1.19 U/mL，4种自由基清除率最高，分别为82.51%，68.45%，77.26%和62.69%，还原力为2.18（OD700nm值）。

综上所述，苹果酵素自然发酵中，当发酵条件为初始pH 4.5，糖添加量15.00%，料液比值200 g/L时，产品的品质及生物活性最高。有研究表明，食用植物酵素的品质及生物活性与植物本身有较大的关系[34]，因此，有关苹果酵素品质与生物活性变化与原料的关系，以及自然发酵过程中的变化规律有待于进一步研究。