花椒叶挥发油的提取工艺优化及抗氧化活性

罗爱国，杨奇秦，李智博，杨艳君，胡变芳

晋中学院生物科学与技术系（晋中 030619）

花椒（ZanthoxylumL.）又名大椒，为芸香科、花椒属落叶灌木，是一种传统的药食两用食物[1-2]，也是中国传统调味品[3]。据中国林业年鉴统计数据，2018年中国花椒产量约45.85万 t。花椒叶作为花椒种植采收产业的最大副产物，资源丰富，但是没有被充分综合利用，大量花椒叶被丢弃或焚烧[4]。研究表明，花椒含有多种对人体有益的活性物质，挥发油是其主要活性成分之一[5]，具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤和抗动脉粥样硬化等多种功效[5-8]，此外还可缓解疼痛、活血化瘀[5,9]，因此挥发油在食品加工和医药行业具有较好的应用前景。

花椒叶挥发油成分复杂，樊经建[10]用水蒸气蒸馏方法制备花椒叶挥发油并以气质联用仪对其进行成分分析，鉴定出化合物15种，定量9种。李焱等[11]研究得出微波辅助萃取法提取花椒叶挥发油的最佳工艺条件为液料比5∶1、提取功率464 W。周江菊等[12]对樗叶花椒叶精油成分及抗氧化活性进行化学分析，得出该种花椒叶是一种天然的抗氧化剂和清除亚硝酸根离子的活性物质。不同产地的花椒叶挥发油的含量及抗氧化活性差别较大[13]。试验以芮城产花椒叶为材料，结合单因素试验和正交试验法对花椒叶挥发油提取工艺进行优化，同时对花椒叶挥发油的抗氧化活性进行初步探究，以期为芮城花椒叶的进一步开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花椒叶（产自山西省运城市芮城，干燥后粉碎，过0.425 mm筛）。

石油醚（沸程60～90 ℃，分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司）；正己烷（分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司）；邻苯三酚（分析纯，北京索莱宝科技有限公司）；抗坏血酸（分析纯，北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

电子分析天平（FR1004，常州市幸运电子设备有限公司）；电热恒温水浴锅（DZKW-D-2，天津天泰仪器有限公司）；旋转蒸发器（RE-52系列，上海亚荣生化仪器厂）；电热鼓风干燥机（BGZ-70，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；紫外可见分光光度计（EV-2000，上海昂拉仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 花椒叶挥发油的提取

参照文献[14]的方法略作修改。精确称取5 g花椒叶粉末，装入滤纸包，用细绳绑好滤纸包，将滤纸包精密称质量后置于250 mL烧杯中，加入提取剂，在设定好的温度下进行提取，提取时用封口膜密闭烧杯。提取完成后取出滤纸包于40 ℃干燥3 h，精密称质量。用旋转蒸发器浓缩提取液，后将花椒叶挥发油低温保存在密闭棕色瓶中。试验完成后根据式（1）计算花椒叶挥发油提取率。

式中：M1为未经提取的花椒叶滤纸包质量，g；M2为经过提取并且充分干燥后花椒叶滤纸包质量，g；M为滤纸包内花椒叶粉末质量，g。

1.3.2 椒叶挥发油提取工艺的优化

1.3.2.1 单因素试验

1.3.2.1.1 提取剂对花椒叶挥发油提取率的影响

按照1.3.1挥发油提取方法，在提取温度60 ℃、料液比1∶15（g/mL）、提取时间2 h条件下，考察不同提取剂（乙酸乙酯、乙醚、石油醚、正己烷）对花椒叶挥发油提取率的影响。

1.3.2.1.2 提取温度对花椒叶挥发油提取率的影响

按照1.3.1挥发油提取方法，提取剂采用石油醚，在料液比1∶15（g/mL）、提取时间2 h条件下，考察不同提取温度（35，45，55，65和75 ℃）对花椒叶挥发油提取率的影响。

1.3.2.1.3 提取时间对花椒叶挥发油提取率的影响

按照1.3.1挥发油提取方法，提取剂采用石油醚，在料液比1∶15（g/mL）、提取温度60 ℃条件下，考察不同提取时间（1，2，3，4和5 h）对花椒叶挥发油提取率的影响。

1.3.2.1.4 料液比对花椒叶挥发油提取率的影响

按照1.3.1挥发油提取方法，提取剂采用石油醚，在提取温度60 ℃、提取时间2 h条件下，考察料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30 g/mL）对花椒叶挥发油提取率的影响。

1.3.2.2 正交试验

根据单因素试验结果，在确定提取剂的基础上，选择提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）3个因素为影响花椒叶挥发油提取率的主要因素，结合正交设计原理，运用L9(33)进行因素水平安排和试验设计（表1）。

表1 正交试验因素水平

1.3.3 花椒叶挥发油抗氧化活性的测定

1.3.3.1 挥发油对DPPH自由基清除能力的测定

依据文献[12]方法，稍加改动。取2.0 mL花椒叶挥发油提取液，加入2.0 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液，混匀后室温避光反应25 min，以无水乙醇为空白对照，在517 nm处测得的吸光度为As；测得2.0 mL蒸馏水+2.0 mL DPPH溶液的吸光度为A0；2.0 mL样品溶液+2.0 mL无水乙醇的吸光度为Ac。用VC作对照[12,15]，试验重复3次，取平均值。挥发油对DPPH自由基清除率按式（2）计算。

1.3.3.2 挥发油对羟自由基清除能力的测定

向试管中加入0.5 mL 10 mmol/L的水杨酸、1 mL花椒叶挥发油提取液、0.5 mL 10 mmol/L的FeSO4溶液和0.5 mL 30%的H2O2溶液，混匀后在37 ℃下恒温反应10 min，在510 nm处测定吸光度A1；按照上述条件不变，用蒸馏水替换H2O2溶液，记录其吸光度A2；不加样品测定的吸光度为A0。以VC做对照试验，每组3次重复，取平均值。羟自由基清除率按式（3）计算。

1.3.3.3 挥发油清除超氧阴离子能力的测定

吸取3 mL浓度50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.2），置于25 ℃水浴中预热20 min后加入0.5 mL花椒叶挥发油提取液和0.6 mL 25 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后于25 ℃水浴保温5 min，取出后加入0.5 mL 8 mmol/L的HCl，在299 nm下测定吸光度，记为A1；以蒸馏水代替花椒叶挥发油提取液，测定的吸光度记为A0。以VC做对照试验。按式（4）计算超氧阴离子（O2-）清除率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取剂对花椒叶挥发油提取率的影响

提取剂对花椒叶挥发油提取率的影响结果见图1。由图1可知，4种溶剂对花椒叶挥发油的提取率分别为4.01%，3.44%，4.65%和3.75%，因此，选用脂溶性较强的石油醚作为提取剂，花椒叶挥发油提取率较高。

图1 提取剂对花椒叶挥发油提取率的影响

2.1.2 提取温度对花椒叶挥发油提取率的影响

提取温度对花椒叶挥发油提取率的影响结果见图2。由图2可知，花椒叶挥发油的提取率随着温度的升高而升高，提取温度达到65 ℃时，花椒叶挥发油提取率达到最高，而随着温度继续升高，花椒叶挥发油提取率呈下降趋势，这可能是由于一方面，花椒叶挥发油不稳定，温度过高会使其挥发，使得率降低；另一方面，温度过高使得石油醚挥发速度过快而无法继续进行试验。因此，选择花椒叶挥发油的提取温度55，65和75 ℃进行后续试验。

图2 提取温度对花椒叶挥发油提取率的影响

2.1.3 提取时间对花椒叶挥发油提取率的影响

提取时间对花椒叶挥发油提取率的影响结果见图3。从图3可以看出，随着提取时间延长，花椒叶挥发油提取率逐渐升高，且在3 h时达到最高，之后稍有下降，并逐渐趋于平稳，出现这种现象可能是由于长时间的提取，挥发油部分成分不稳定而分解。因此，选择花椒叶挥发油提取时间2，3和4 h进行后续试验。

图3 提取时间对花椒叶挥发油提取率的影响

2.1.4 料液比对花椒叶挥发油提取率的影响

料液比对花椒叶挥发油提取率的影响见图4。由图4可知，料液比1∶20（g/mL）时，花椒叶挥发油提取率最高，为4.79%，超过20倍量时，逐渐趋于稳定。总体而言，花椒叶挥发油提取率在设定的料液比梯度范围内波动不大，受料液比的影响程度较小。因此，选择花椒叶挥发油提取料液比1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）进行后续试验。

图4 料液比对花椒叶挥发油提取率的影响

2.2 正交试验结果

由正交试验结果（表2）可知，影响花椒叶挥发油提取率的3个因素对试验结果的影响顺序为B＞A＞C，即提取时间是对花椒叶挥发油提取影响最大的因素，提取温度次之，料液比的影响最小。方差分析结果（表3）表明，提取温度和提取时间对花椒叶挥发提取率的影响显著（0.01＜p＜0.05），料液比对试验结果的影响不显著。结合正交试验结果和方差分析结果，提取花椒叶挥发油的最佳工艺水平为A2B2C3，即提取温度65 ℃、提取时间3 h、料液比1∶25（g/mL）。

表2 L9(33)正交试验结果与分析

表3 方差分析

2.3 抗氧化活性分析

VC和花椒叶挥发油抗氧化活性比较见图5。花椒叶挥发油对DPPH自由基、羟自由基和超氧自由基具有较好的清除作用，清除率分别为91.67%，71.30%和64.25%。与VC相比，花椒叶挥发油清除DPPH自由基和超氧自由基的能力优于VC，而对羟自由基的清除能力低于VC。

图5 VC和花椒叶挥发油抗氧化活性比较

3 结论

试验采用有机试剂热浸法提取花椒叶挥发油，以挥发油提取率为评价指标，结合单因素和正交设计，研究提取剂、提取温度、提取时间、料液比对花椒叶挥发油提取的影响，得出花椒叶挥发油的最佳提取工艺：提取剂采用石油醚，提取温度65 ℃，提取时间3 h，料液比1∶25（g/mL）。在此条件下花椒叶挥发油的提取率最高，为5.97%，且各因素对花椒叶挥发油提取影响程度由强到弱依次为提取时间＞提取温度＞料液比。此外，以VC为对照，评价花椒叶挥发油的抗氧化能力，结果表明花椒叶挥发油对DPPH自由基和超氧自由基的清除率大于VC，具有较强的抗氧化能力，说明花椒叶挥发油具有开发成为功效较好的天然抗氧化物质的潜能。后续可对花椒的不同提取物的抗氧化性能深入研究，有望在食品加工和医药等方面发挥更大价值。