他克莫司液相色谱串联质谱试剂盒性能评价及临床应用

杭 红 ，邢 晗 ，张 天 ，朱 磊 ，李 宇 △

（1. 上海药明奥测医疗科技有限公司，上海 200125； 2. 郑州大学第一附属医院药学部，河南 郑州 450052）

他克莫司（tacrolimus）又名FK506，属链霉菌属中分离出的大环内酯类新型免疫抑制剂，可通过抑制白细胞介素 2（IL －2）、γ 干扰素的释放，抑制 T 淋巴细胞的增殖和活化，从而抑制免疫反应。他克莫司是肝脏、心脏、肾脏及骨髓移植患者的首选免疫抑制药物，移植后排斥反应对传统免疫抑制方案耐药者，也可选用该药［1－2］。近几年，他克莫司也用于抑制溃疡性结肠炎患者的炎性反应［3］。他克莫司的治疗窗窄，且药代动力学个体差异大，使用标准起始剂量后，有的患者由于血药浓度低，未达到有效治疗浓度而产生急性排斥反应；有的患者由于血药浓度高而产生系列毒副反应，如肝肾毒性、神经毒性、血糖代谢紊乱、脂代谢异常等，因此临床使用他克莫司需进行血药浓度监测［4－5］。

目前用于测定全血中他克莫司血药浓度的方法主要包括微粒子酶联免疫法（MEIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）、酶放大免疫测定法（EMIT）、液相色谱串联质谱法（LC－MS／MS）等。免疫学方法所用单克隆抗体与他克莫司代谢物存在交叉反应，过高地估计了他克莫司的浓度，不适于其药代动力学分析［6］。LC －MS ／MS 法测定结果为他克莫司原形药物浓度，能更准确地说明药物浓度－疗效－不良反应三者间的关系。同时，LC－MS／MS 法具有分析时间短、样本处理快速、特异性强、准确度高、灵敏度高、成本低等优点［7－8］，目前在国内外已成为监测患者他克莫司血药浓度的主要方法。国内他克莫司血药浓度的监测是基于各医学实验室的自建方法，溯源链及方法缺乏统一标准。另外，实验室间的资质与能力有较大差距，给监管造成较大困难。同时，由于这些自建方法均未在《医疗机构临床检验项目目录（2013 版）》中，因此，其大规模开展面临相关法规难题。本研究中根据体外诊断试剂（IVD）注册法规的要求，开发了他克莫司LCMS／MS 试剂盒，产品溯源至美国药典（USP），开展了试剂盒关键性能评价，并进行了方法学比对。现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY I－S 型超高效液相色谱串联质谱系统（美国 Waters 公司）。

1.2 试药

他克莫司标准品（USP，批号为R055E0；加拿大TLC Pharmaceutical Standards 公司，批号为 1418 －091A1；含量97.9%）；子囊霉素（加拿大 Toronto Research Chemicals 公司，批号为2－LWJ－45－1）；他克莫司测定试剂盒（苏州药明泽康生物科技有限公司）；兔全血（上海源叶生物科技有限公司）；甲醇、甲酸、甲酸铵均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 试验条件

色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为 0.1%甲酸4 mmol／L 甲酸铵水溶液（A）－ 0.1% 甲酸 4 mmol／L 甲酸铵甲醇溶液（B），梯度洗脱 （0 ～0.2 min 时 80%A，0.2 ～ 0.8 min 时 80%A→2%A，0.8 ～1.4 min 时 2%A，1.4 ～1.5 min 时 2%A→80%A，1.5 ～1.8 min 时80%A）；流速为 0.6 mL ／min，柱温为 60 ℃，进样量为 2 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子模式，扫描类型为多反应监测模式（MRM）；毛细管电压为3.0 kV；去溶剂化温度为500 ℃；去溶剂化流速为1 100 L／h，锥孔流速为150 L／h；雾化压力为7.0 Bar。他克莫司及内标子囊霉素MRM 信息见表1。

表1 他克莫司及内标子囊霉素MRM 参数Tab.1 MRM parameters of tacrolimus and internal standard ascomycin

2.2 校准品和质控品制备

称取他克莫司标准品（TLC 公司）适量，用甲醇溶解制成他克莫司质量浓度为1 mg／mL 的贮备液；用甲醇稀释，得他克莫司次级贮备液（10 μg／mL）；采用兔全血稀释，得他克莫司高浓度兔全血溶液（200 ng／mL）；再与空白兔全血通过称重稀释法得到校准点C6 溶液（50 ng／mL）；校准点C6 溶液与空白兔全血采用称重稀释法得到校准点 C1 至校准点 C5 溶液，质量浓度分别为 2，5，10，20，30 ng／mL。质控品配制工艺与校准品相同，由上述高浓度兔全血溶液与空白兔全血通过称重稀释法得到高浓度质控点（HQC）溶液（30 ng／mL）；HQC 溶液与空白兔全血采用称重稀释法得到低质量浓度质控点（LQC）溶液（6 ng／mL）和中质量浓度质控点（MQC）溶液（15 ng／mL）。

2.3 溯源链建立

他克莫司测定试剂盒校准品的溯源执行GB ／T 21415 － 2008 标准［9］。他克莫司校准品溯源至美国药典他克莫司标准品。试剂盒以美国药典他克莫司标准品建立溯源链，并以其为溯源链的终点。用美国药典他克莫司标准品绘制标准曲线，对工作校准品进行定值，并以此建立的标准曲线对产品校准品进行定值（图1）。在常规样品检测中，以产品校准品建立标准曲线，计算常规样本中他克莫司和其内标峰面积比值，并代入校准曲线后得结果。

图1 他克莫司试剂盒校准品溯源链Note：a represents one or more existing measurement systems calibrated with primary or secondary calibrators，and b represents one or more manufacturer working calibrators or higher calibrators calibration.Fig.1 The traceability chain of tacrolimus kit

2.4 精密度性能评价

参考美国临床和实验室标准协会（CLSI）颁布的EP5－A2 标准进行精密度试验，主要涵盖室内精密度、批内精密度、批间精密度和日间精密度。每天从3 个生产批次的试剂盒中分别抽取2 盒，每个生产批次独立进行试验和数据分析。精密度试验的样本采用兔全血制备的溶液，包含低、中、高 3 个质量浓度（6，15，30 ng ／mL）。

试验程序：1）2 位试验员均分别检测每个分析批次；2）每个分析批次从3 个生产批次中分别抽取1 盒待评价试剂盒，检测高、中、低3 个质量浓度的精密度参考品，每个质量浓度重复测定2 次；3）获得20 d 的有效数据，试验分别由2 台仪器间隔进行；4）最终每个质量浓度得到80 个检测结果。统计每个分析批次各质量浓度下的批内及总精密度，分别用变异系数（CV批内、CV总）表示，反映试剂盒真实的精密度参数［见表2，表中 Sr为预估重复性标准差，ST为预估仪器内或室内精密度，为预估日间标准差，Srr为预估批间标准差），CV总＝，L，M，H 分别为低、中、高质量浓度企业参考品］。由表2 可知，试剂盒总精密度范围在4.07% ～5.57%，符合法规规定的总精密度要求。

表2 他克莫司试剂盒精密度性能评价结果Tab.2 Performance evaluation of the precision of tacrolimus kit

2.5 临床比对试验

选择120 例临床样本，以他克莫司检测试剂盒为评价试剂，选择参考实验室方法为参比试剂进行方法学比对研究，评价试剂与参比试剂的相关性和一致性，同时评价EMIT 法试剂盒与参比试剂的相关性和一致性。EMIT 法采用均相酶免疫测定法来分析全血中他克莫司的浓度，检测方法参考该试剂盒说明书进行。参考实验室具有美国病理学会（CAP）认证的相关检测资质，他克莫司检测项目参考相关法规经严格的方法学验证，符合CAP 的认证要求，临床评价过程符合国家药品监督管理局的法规规定。

针对120 例临床样本检测值分别做散点图进行相关性分析及一致性分析（Bland－Altman 分析，采用差值－均值图）［10－13］。如图 2 A 所示，以参比试剂检测值（ X）为横坐标、评价试剂检测值（ Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程 Y1＝ 1.013 1 X1＋ 0.023 3，R2＝ 0.989 3，r ＝ 0.994 6≥0.975，表明两方法相关性良好。

对比试剂（EMIT 法）与参比试剂临床样本检测值的相关性分析见图2 B。由于EMIT 法对120 例临床样本中的7 例检测值超出其线性范围的高点（30 ng／mL），因此EMIT 法与参比试剂检测值的相关性及一致性分析以剔除7 例后的113 例样本进行分析。以参比试剂检测值（ X）为横坐标、免疫法测定值（ Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y2＝ 20.922 2 X2＋ 2.427 2，R2＝0.677 0，r ＝ 0.822 8≤0.975，表明两方法相关性较差。

评价试剂与参比试剂临床样本检测值的一致性分析见图3 A，以2 种方法测定的均值（X）为横坐标、差值（Y）为纵坐标。考虑到抽样误差，上下 ±1.96 SD 2 条水平实线为一致性界限的95%置信区间上下限，中间实线代表2 种方法检测值差值的均值。2 种方法检测值差值均值为 0.23 ng ／mL，标准差为 0.77，差值一致性界限的可信区间为 －1.524 ～1.980 ng／mL，在一致性界限的可信区间内共有 117 个点，占 97.50%（117 ／120），满足95%的点落在一致性界限内，表明评价试剂与参比试剂的测定结果一致性良好。

图2 样本他克莫司检测方法间的相关性A.Evaluation and reference reagents B.EMIT and reference reagentsFig.2 Correlation analysis of different measuring methods of tacrolimus from clinical samples

图3 样本他克莫司检测方法间的一致性A.Evaluation and reference reagents B.EMIT and reference reagentsFig.3 Consistency analysis of different measuring methods of tacrolimus from clinical samples

对比试剂（EMIT 法）与参比试剂临床样本检测值的一致性分析见图3 B，2 种方法检测值差值的均值为1.30 ng／mL，标准差为 3.56，差值的一致性界限的可信区间为 －6.816 ～9.422 ng／mL，在一致性界限的可信区间内共有 106 个点，占 93.81% （106 ／113），未满足95%的点落在一致性界限内，表明免疫法与参比试剂的测定结果一致性较差。

2.6 正确度性能评价

正确度的评价主要有以下2 种方式：1）与国家标准品（或国际标准品）的靶值进行比对，观察对相应标准品检测结果的偏差情况，评价试剂实测值与相应国家（国际）标准品的相对偏差应不超过±15%。2）使用配制的已知分析物浓度的样本，检测结果和配制后应得的靶值比较，计算回收率（应在 85% ～ 115% ）［14］。由于无他克莫司检测的国家参考品，国际标准品也难以获取，本研究中采用了第2 种方案，即制备已知质量浓度的20 例全血样本，其质量浓度覆盖方法的线性范围，对临床样本进行编号及分装后分别采用实验室自建方法（参比试剂、LC－MS／MS 法）、质谱法试剂盒（LC －MS ／MS 法，评价试剂）、免疫法试剂盒（EMIT 法，对比试剂）进行双份测定，统计评价试剂的正确度（回收率）。由表3 可见，评价试剂20 例样本回收率为 93.1% ～97.9%，样本检测值正确度高，符合分析性能要求。

本研究中对LC－MS／MS 法和EMIT 法试剂盒与参比方法间的相关性进行了分析。质谱试剂盒与参比试剂样本检测值的相关性分析见图4 A。以参比试剂检测值（ X）为横坐标，质谱试剂（评价试剂）检测值（ Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y3＝1.034 3 X3－0.399，R2＝ 0.997 9，r ＝ 0.998 9≥0.975，表明 2 种方法相关性良好。图4 B 中，以参比试剂检测值（ X）横坐标、免疫法检测值（ Y）纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y4＝1.049 3X4＋1.364 2，R2＝0.974 6，r ＝0.987 2≥0.975，表明2 种方法相关性良好。免疫法与参比方法检测值相比，偏差范围为－3.2% ～29.9%，检测值整体偏高，而质谱试剂盒与参比方法检测值的偏差范围为－10.9% ～7.7%，表明质谱法试剂盒检测值的正确度优于免疫法。

3 讨论

3.1 他克莫司试剂盒校准品溯源链

他克莫司测定试剂盒具有完整的溯源链，产品校准品溯源至美国药典他克莫司标准品，能保证测量结果在不同时间、不同空间的可比性，以及产品质量的可控性和可延续性，从而保证诊断的正确。校准品的溯源性保证了他克莫司试剂盒在临床评价中与参比试剂的相关性及一致性，在正确度性能评价中回收率为93.1% ～97.9%。

表3 他克莫司试剂盒正确度性能评价结果Tab.3 Performance evaluation of the accuracy of tacrolimus kit

3.2 他克莫司试剂盒的精密度

图4 加标样本他克莫司检测方法间的相关性A.Spiked samples of evaluation and reference reagents B.Spiked samples of EMIT and reference reagentsFig.4 Correlation between the different measuring methods of tacrolimus from the spiked samples

精密度是体外诊断试剂基本分析性能之一，也是其他方法学评价的基础。目前，国内外关于精密度性能评价的方案多种多样，他克莫司测定试剂盒参考CLSI 颁布的EP5－A2 进行精密度评价，结果符合法规规定的精密度要求。

3.3 他克莫司不同检测方法间的正确度与一致性

正确度是体外诊断试剂最重要的分析指标，是分析测量范围、参考区间评价等试验的基础。一个可靠的检测方法必须保证较高的准确度，即满足正确度和精密度的要求。溯源链的建立保证了量值传递的正确度。

监测血药浓度的传统方法，如酶联免疫法、化学发光法均为对待测物质进行间接检测，各厂家抗体无法标准化，抗体间的交叉反应导致了特异性不足，影响了方法的准确度。质谱技术是测量分子质荷比的分析方法，是对检测物质直接分析的技术，由于质谱检测技术具有特异性好、灵敏度高、通量高等特点，已逐渐成为血药浓度监测的“金标准”［15］。目前，LC － MS ／MS 法的操作细则还是以实验室自建方法为主，缺乏标准化的规范操作规程，影响了临床应用的推广。按体外诊断试剂注册法规要求开发的他克莫司LC－MS／MS 试剂盒，检测结果的正确度和一致性高于免疫法。试剂盒的推广将有利于精准调整剂量，实施个体化给药，以减少毒副反应、排异反应的发生，为精准医学赋能。