三叶苷对人正常肝细胞L-02增殖作用的研究

李 曦，高健美，龚其万，龚其海

(1.遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099； 2.遵义医科大学 药学院，贵州 遵义 563099； 3.遵义甜丁茶业有限责任公司，贵州 遵义 563000)

目前，肝病患者发病率呈逐年上升趋势，肝炎、肝硬化、急性肝衰竭、肝癌等肝病严重损害人类健康，给患者和社会带来沉重的精神和经济负担[1]。肝脏作为人体内最大的消化器官，具有较强的组织修复和再生能力，当受到急性损伤或其他疾病影响时，会引起肝脏的修复和再生从而迅速的恢复其功能。但是在严重的肝损伤情况下，肝细胞的增殖难以满足肝脏修复的需要，出现肝再生异常[2]。肝脏部分切除术和肝移植是目前国内外治疗多种严重肝脏疾病的有效手段，但手术后易出现肝衰竭等不良反应[3-5]。临床上，促进肝再生的方法主要包括胰蛋白酶抑制剂、肝再生增强剂、皮下肝组织工程等[6-7]，但以上方法可能会导致严重不良反应，例如肿瘤的发生等[8]。因此，探索促进肝再生的方法和策略具有重要意义及广阔的临床应用前景。

木姜叶柯是贵州省民族中药材，味甘、性平，药食兼用，主要分布于我国长江以南各省区，具有清热解毒、护肝补肾、化痰祛风等功效。三叶苷(trilobatin,TLB)是木姜叶柯主要的黄酮类成分之一，具有抗病毒[9]、降糖[10]、神经保护[11]、抗氧化[12]等药理作用。本课题组前期研究表明，木姜叶柯叶水提物和TLB可以促进PC12细胞的增殖[13]，同时，木姜叶柯水提物能通过调控细胞周期相关蛋白和肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)/酪氨酸激酶(Tyrosine kinase,c-Met)信号通路促进人正常肝细胞L-02的增殖[14]。但是，TLB能否促进肝细胞的增殖尚未见报道。基于以上研究背景，本研究旨在探索TLB对人正常肝细胞L-02的增殖作用，并为探索肝脏疾病以及肝再生的治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 人正常肝细胞L-02购自中国科学院细胞库；TLB标准品购自广州科迪生物科技有限公司；RPMI Medium 1640培养基、澳洲胎牛血清、胰蛋白酶及青链霉素混合液购自Gibco公司；噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)购自Sigma公司；5-溴脱氧尿嘧啶核苷酶 (5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)ELISA试剂盒购自广州科迪生物科技有限公司；5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EDU)试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司；GAPDH、β-actin小鼠单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinases 4,CDK4)、肝细胞核因子4α(Hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4α)、cyclin D1、HGF、c-Met、p-c-Met、蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)、p-Akt、细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinase 1/2,Erk1/2)和p-Erk1/2一抗均购自英国abcam公司。

1.2 仪器与设备 Midi40二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；全自动细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)；全波长酶标仪(美国Thermo公司)；超净工作台(天津泰斯特仪器有限公司)；超速冷冻离心机(美国Beckman coulter公司)；Olympus IX53倒置显微镜和Olympus IX73倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；化学发光凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 L-02细胞培养 采用含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液和RPMI Medium 1640培养基配成完全培养基，在5%CO2和饱和湿度的37 ℃恒温孵箱中进行L-02细胞培养[15]。待细胞密度达到80%～90%时，弃去培养基，用磷酸缓冲盐溶液冲洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化传代，用于后续实验。

1.3.2 TLB对L-02细胞活力的影响 将对数生长期的L-02细胞(1×104个/mL)接种于96孔板，培养12 h后弃培养基，分别加入含0、12.5、25、50、100、200 μM TLB的完全培养基，每个浓度设6个复孔，置于孵箱中继续培养。12、24、48、72 h后，分别加入25 μL/孔MTT，于细胞培养箱中避光孵育4 h，吸弃培养基后加入二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)(150 μL/孔)，振摇10 min，待甲瓒晶体溶解后，于全波长酶标仪上在490 nm处测定各孔吸光度值，并计算细胞存活率。

1.3.3 细胞形态学观察 将对数生长期的L-02细胞(1×104个/mL)接种于6孔板，培养12 h后弃培养基，分别加入含0、25、50、100 μM TLB的完全培养基，每个浓度设6个复孔，置于孵箱中继续培养72 h后，在Olympus IX53倒置显微镜下观察细胞形态。

1.3.4 TLB对L-02细胞增殖的作用 药物处理方法同1.3.3，置于孵箱中继续培养72 h后，严格按照BrdU ELISA试剂盒和EDU试剂盒的说明书方法分别检测BrdU和EDU的水平。

1.3.5 免疫印迹法(Western blot,WB)检测L-02细胞中相关蛋白的表达 药物处理方法同1.3.3，72 h后提取蛋白，按照BCA蛋白定量试剂盒说明书操作确定总蛋白浓度，经过蛋白变性、上样、电泳、电转等操作后，进行相应的抗体孵育，通过化学发光凝胶成像系统显影，分析目的蛋白条带及相应的内参条带。

2 结果

2.1 TLB对L-02细胞活力的影响 通过MTT法确定TLB对L-02细胞活力的影响。实验结果表明，25～200 μM TLB作用L-02细胞48 h和72 h能够明显提高L-02的细胞活力(P<0.05、P<0.01，见图1)。由于TLB作用72 h较48 h促增殖效果更明显且呈浓度依赖性，TLB 100 μM和200 μM两个浓度促增殖效果最佳且两者的促增殖效果无差异，因此，本研究选择25、50、100 μM的TLB作用L-02细胞72 h进行后续实验。

与对照组相比，*：P<0.05，**：P<0.01，n=6。

2.2 TLB对L-02细胞形态的影响 通过倒置显微镜观察TLB对L-02细胞形态的影响。研究结果表明，与对照组相比，25、50、100 μM TLB给药组细胞数量明显增多(见图2)。以上研究结果显示，TLB可以显著提高L-02的细胞活力。

图2 经TLB处理后L-02细胞的细胞形态

2.3 TLB对L-02细胞增殖的影响 采用ELISA法和荧光染色法观察TLB对L-02细胞增殖的作用。研究结果显示，与对照组比较，25、50、100 μM TLB给药组BrdU水平明显升高(P<0.01，见图3)。同时，与对照组相比，25、50、100 μM TLB给药组细胞荧光强度明显增强，增殖细胞数量明显增加(P<0.01，见图4)。以上结果表明，TLB能够明显促进L-02细胞增殖。

**：与对照组相比，P<0.01，n=6。

A：EDU染色观察细胞增殖；B：细胞增殖的定量。**：与对照组相比，P<0.01，n=6。

2.4 TLB对L-02细胞周期相关蛋白的作用 采用WB法观察TLB对L-02细胞周期相关蛋白表达的作用。研究结果表明，50、100 μM TLB组CDK4蛋白表达较对照组明显增加(P<0.01，见图5 A、B)，25、50、100 μM TLB组的cyclin D1蛋白表达较对照组明显增加，而25、50、100 μM TLB组的HNF4α蛋白表达较对照组明显降低(P<0.01，见图5 C～E)。

2.5 TLB对L-02细胞中相关蛋白表达的影响 通过WB法观察L-02细胞中HGF、c-Met、Akt和Erk1/2的蛋白表达。研究结果表明，25、50、100 μM TLB组HGF蛋白表达和c-Met磷酸化水平较对照组明显增加(P<0.05、P<0.01，见图5 F～I)。此外，25、50、100 μM TLB组的Akt磷酸化水平和Erk1/2磷酸化水平较对照组明显升高(P<0.05、P<0.01，见图5 J～M)。

A：CDK4的代表性条带；B：CDK4蛋白表达量化图；C：cyclin D1和HNF4α的代表性条带；D：cyclin D1蛋白表达量化图；E：HNF4α蛋白表达量化图；F：HGF的代表性条带；G：HGF蛋白表达量化图；H：p-c-Met的代表性条带；I：c-Met磷酸化水平；J：p-Akt的代表性条带；K：Akt磷酸化水平；L：p-Erk1/2的代表性条带；M：Erk1/2磷酸化水平。与对照组相比，*：P<0.05；**：P<0.01，n=3。

3 讨论

我国中草药治疗各种疾病历史悠久，近年来大量研究发现中药复方、中药单方或中药单体成分具有较好的保肝或促进肝再生的作用，例如：大黄水煎醇沉提取液可增强大鼠肝再生过程中相关信号调节蛋白的表达，从而促进肝细胞增殖和肝再生[16]；牛黄参可以上调促肝细胞生长因子的表达，进而促肝细胞增殖[17]；槲皮素能够通过抗氧化、抗凋亡发挥促进肝细胞增殖作用[18]。TLB是木姜叶柯主要活性成分之一，目前对TLB的药理作用研究较少，因此，本研究观察了TLB对人正常肝细胞L-02的促增殖作用。L-02细胞由人肝脏胚胎细胞分离，保留了肝细胞的稳定性、不可逆性等多种典型特性，具有完整的人代谢活化酶，常作为研究肝细胞增殖的体外模型[19]。

MTT法是检测细胞存活和生长的经典方法之一，MTT结晶量可以反映出活细胞的数量，同时吸光度值越大，细胞活力越强[20]。本研究结果发现，TLB能够增强L-02细胞活力且细胞数量明显增多，但此结果仅能说明TLB对L-02细胞活力具有促进作用，并不能反映TLB具有促进细胞增殖的作用。因此，本研究通过BrdU ELISA法和EDU荧光染色法进一步分析TLB是否具有促进L-02细胞增殖的作用。BrdU作为DNA前体胸腺嘧啶核苷的类似物，在DNA合成期可替代胸腺嘧啶，因此，常用来标记细胞增殖[21]。在固相抗体中加入BrdU，再与辣根过氧化物酶标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，再经一系列操作后用全波长酶标仪检测吸光度，从而反映出细胞增殖程度。本研究结果显示，TLB能够显著增加L-02细胞中BrdU水平，表明TLB具有促进L-02细胞增殖的作用。EDU作为胸腺嘧啶核苷类似物能够代替胸腺嘧啶在细胞增殖时期进入DNA分子中，通过与相关荧光染料的特异性反应从而检测出DNA复制活性，可以准确表现细胞的增殖能力[22-23]。与BrdU相比，EDU能更快速的反映细胞和组织水平的DNA复制活性，本研究结果表明TLB作用L-02细胞后荧光强度明显增强，进一步证实了TLB对L-02细胞的促增殖作用。

细胞增殖是生命体重要的生理功能之一，在多种细胞和调控因子的作用下，通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等反应进行分裂、增殖。Cyclin D1的表达是细胞增殖阶段一个重要的调控位点，其通过结合和激活细胞周期中G1期的CDK4蛋白，抑制周期抑制蛋白、视网膜母细胞瘤样蛋白2等细胞周期相关调节蛋白的磷酸化，从而促进DNA复制以及细胞增殖[3,24]。与之相反，下调cyclin D1和CDK4的表达可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。有研究表明，肝脏中关键的细胞周期蛋白HNF4α和cyclin D1之间的负调控对肝再生中的细胞周期具有调节作用[25]。肝脏中HNF4α表达降低会上调cyclin D1的表达并促进肝细胞增殖，而cyclin D1降低或缺失则会抑制肝细胞的增殖，同时增强HNF4α蛋白的表达，提示HNF4α可能通过抑制cyclin D1的表达进而抑制肝细胞的增殖。因此，本研究通过WB法检测L-02细胞中周期相关蛋白表达的结果表明，TLB能够上调CDK4、cyclin D1的蛋白表达，降低HNF4α的蛋白表达，提示TLB可通过调控cyclin D1、HNF4α、CDK4的表达促进肝细胞增殖。

最近研究发现，HGF作为调节多种细胞增殖的多肽生长因子能够促进细胞分裂、血管生成、营养物质吸收和组织再生修复等[26]。HGF与其受体c-Met结合并触发多种细胞内信号反应，参与细胞增殖和分化以及组织再生和修复，导致受体二聚化和酪氨酸残基被磷酸化[27-28]，随后激活其下游信号分子，参与多种信号转导途径，包括信号转导与转录激活因子、黏着斑激酶、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号途径等。大量实验研究表明，PI3K/Akt和 MAPK/Erk通路的激活可以调控多种细胞的增殖，生长，凋亡，血管生成以及肿瘤的发生发展。因此，本研究通过WB法观察了TLB对L-02细胞中HGF、c-Met、Akt及Erk1/2的蛋白磷酸化水平的影响。研究结果显示，TLB能够通过上调HGF蛋白表达、增加c-Met和下游的Akt、Erk1/2磷酸化水平，从而促进L-02细胞增殖。虽然，本研究初步证实了TLB促进肝细胞增殖的作用，但是其作用靶点尚不清楚。在未来的实验中，我们将通过肝损伤动物模型并借助基因沉默等手段进一步探究TLB促进肝细胞增殖的作用机制。

综上所述，TLB对人正常肝细胞L-02具有促增殖作用，其机制可能与调控HGF/c-Met信号途径有关。