高粱枯萎病生防菌株筛选研究

马文旭，陈如男，刘新宇，李博浩，贾文宝，张严文，杨 雁，赵千慧，曹东歌，于高波，魏金鹏

(黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319)

高粱是世界上重要的杂粮作物，常被用作制糖、酿酒等工业原料，是我国粮食化产业必不可少的农作物之一。而高粱病害是制约其产量的重要因素之一，高粱病害约有60余种[1]，发生较普遍的有15种[2]。其中由半裸镰刀菌侵染引起的高粱枯萎病发生较为严重，在高粱生长到4～5片叶时即可发生，且为土传病害。已有研究表明其致病菌为镰刀菌属，其可在土壤中传播，通过高粱根系侵入其地上部分，导致高粱生长缓慢，叶片枯萎等，严重时可导致高粱产量显著下降[3]。除此以外，孙纪申等[4]研究发现半裸镰刀菌是高粱、小麦等粮食上常见的污染菌，其菌内含致癌物可致大鼠淋巴肉瘤和膀胱乳头瘤，但能否引起人类肿瘤尚在研究。目前针对农作物病害的主要防治措施包括选育抗病品种、采用轮套作、使用化学农药等方法，但抗病品种存在选育年限较长、品种适种地域有限的问题，轮作方式也存在时间周期长、经济效益受影响等问题。化学农药在一定程度上能抑制植物病害的发生，贺新生等[5]发现克霉灵可有效抑制半裸镰刀菌的菌丝体生长与孢子萌发，但是会产生农药残留危害与环境污染问题。而随着人们的环境保护观念越来越强，对绿色无公害、健康无污染农副产品的需求也越来越高。生物防治具有无毒、健康无污染等优点[6]，因此，采用生物防治实现绿色生产，为农业的可持续发展提供重要的保障。

事实上，生物防治已成为解决作物病害的重要防治方法之一。近年来关于高粱生防菌的研究也逐步增多，Sollepura等[7]筛选出20种具有生防潜力和促进高粱生长的内生真菌，姜钰等[8]针对高粱靶斑病的生防防治开展了相关研究。对于镰刀菌所引起的病害，在生防菌的研究方面有较多相关研究。已有研究发现对黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、番茄黄萎病等多种病原菌有抑制作用的生防菌株，季倩茹等[9]发现芽孢杆菌对黄瓜枯萎病具有良好的防病促生效果，但对于高粱枯萎病致病菌——半裸镰刀菌的生防研究甚少。因此，高粱枯萎病的生防菌筛选及生物防治作用已成为高粱绿色生产亟待解决的关键问题。因此，本研究从黑龙江省大庆市的健康高粱根际土壤中筛选出33种具有拮抗效果的生防细菌，通过平板对峙试验与盆栽接种试验进行筛选，并对半裸镰刀菌有良好生防效果的菌株进行分子鉴定及生防作用研究，以期为防治高粱枯萎病的菌剂研发奠定基础，也为实现高粱的绿色生产提供理论依据与技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物材料 克杂1号高粱品种，由国家杂粮工程技术研究中心提供。

1.1.2 供试菌株 病原菌：半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)由黑龙江八一农垦大学台莲梅教授提供。生防菌：本试验从黑龙江省大庆市的健康高粱根际土壤中分离纯化，并经过初步的抑菌谱筛选出生防菌株33种。

1.1.3 供试培养基 PDA培养基，牛肉膏蛋白胨培养基。

1.2 方法

1.2.1 平板对峙法初筛生防菌 将半裸镰刀病原菌活化，将直径6 mm的菌碟置于平板培养基的中心，将生防菌菌液接种于平板1/4处，以单独接种病原菌为对照，28℃下培养3 d，并进行多次重复，计算抑菌率，筛选抑菌效果较好的拮抗菌[10]。

抑菌率(%)=(对照病原菌半径-生防菌对峙的病原菌半径)/对照病原菌半径×100

1.2.2 生防菌分子鉴定 将筛选出来的4种菌株通过细菌基因组试剂盒进行提取16SrDNA并进行PCR扩增，扩增引物为F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’与R:5’-TACCTTGTTACGACTT-3’，反应程序：94℃5 min；94℃1 min；72℃2 min；35Cycles；72℃7 min，4℃保存，电泳检测，PCR产物测序，测序结果进行同源性比对(http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)，选择同源性99%以上的序列用MEGA7.0建立发育树，确定菌株的种属。

1.2.3 生防菌对高粱枯萎病影响的盆栽试验 盆栽试验设置6个处理，处理1：不接种任何菌种，只处理灭菌水为对照(CK)；处理2：单独接种半裸镰刀病菌(F)；处理3：接种生防菌Y+6后接种半裸镰刀病菌(Y+6)；处理4：接种生防菌7后接种半裸镰刀病菌(7)；处理5：接种生防菌Y+8后接种半裸镰刀病菌(Y+8)；处理6：接种生防菌10+8-20后接种半裸镰刀病菌(10+8-20)；每个处理3次重复，每个重复15株高粱。接菌方式为灌根处理(10 ml)：病原菌接菌采用半裸镰刀病原菌孢子悬浮液(1×108cfu·mL-1)，生防菌采用生防菌菌液(OD600=0.7)。于高粱4片真叶时，CK与F处理采用蒸馏水灌根，其他4个处理分别接菌对应的生防菌，于生防菌接菌7d后，进行病原菌接菌，其中F只接种病原菌，其他4个处理同时接种生防菌与病原菌，发病后调查发病率与病情指数[10]。

病情指数=100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)

发病率(%)=(染病株数/调查总株数)×100

1.2.4 植物细胞活性及活性氧检测 H2O2采用DAB染色方法，ROS采用NBT染色方法，具体参考吴颖静等方法[11]，Evans Blue染色参考刘楠等方法[12]。

1.2.5 防御酶活性测定 PAL活性参照He等方法，采用苯丙氨酸检测方法，测定OD290吸光值[12]。PPO活性参照He等方法，采用邻苯二酚方法，测定OD398吸光值[13]。

1.2.6 抗氧化酶活性测定 0.5 g高粱叶片50 mol·L-1用预冷PBS缓冲溶液研磨成匀浆， 12 000 r·min-1，4℃离心20 min，上清液即为抗氧化酶的粗酶液。SOD酶活性测定采用氮蓝四唑法[14]，POD酶活性采用愈创木酚法，CAT、APX酶活性测定参照Zhang等的方法[15]。

1.2.7 土壤酶活性测定 高粱根际土样收集利用抖落法取土，土壤脲酶、磷酸酶、多酚氧化酶、纤维素酶参照关松荫土壤酶测定方法，分别采用比色法、磷酸苯二钠比色法、邻苯三酚比色法、硝基水杨酸法测定[16]。

1.2.8 数据与分析 采用Microsoft Excel(2016版)、mega 7.0、spss分析试验数据，采用origin 75制作图表。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的筛选

从33种细菌中筛选获得17种细菌对半裸镰刀菌具有较好抑制效果的菌株，其抑菌率均≥60%，并且病原菌菌丝体生长状态、颜色、形态均与对照差异明显。半裸镰刀菌在正常生长下，菌体为黄白色，菌丝茂密，当与拮抗菌共同生长时，受拮抗菌影响，菌体颜色加深，而拮抗菌生长饱满，具有良好的拮抗效果，且拮抗菌Y+6平板对峙试验中出现明显的抑菌圈(图1，见241页)。经过复筛后得到拮抗效果强且稳定的4种细菌：Y+6、7、Y+8、10+8-20，其抑菌率分别为89.33%、85.87%、83.55%、85%～87%(表1)。

表1 拮抗菌株的抑制率

2.2 拮抗菌的防病盆栽试验

将平板对峙试验筛选出来的拮抗菌进行盆栽接菌试验，结果表明只接种病原菌的高粱植株(CK)在接菌3天后开始发生枯萎现象，而接种拮抗菌对枯萎病的发生有明显的抑制效果，仅叶片有少许病斑，高粱仍然能够正常生长。其中接种拮抗菌Y+8、7、10+8-20、Y+6的拮抗效果比较明显，通过高粱枯萎病的发病率与病情指数调查发现其发病率分别为37.93%、30.77%、30.77%和42.33%，病情指数分别为16.92、30.77、22.12和18.97，显著低于对照及其他处理，其具体病情指数与发病率详见表2。由表2可知，Y+8、7、10+8-20、Y+6这4种拮抗菌接菌对高粱枯萎病的发生具有良好的抑制效果。

表2 拮抗菌株防治高粱的盆栽试验

2.3 菌种分子鉴定

以上述筛选出的生防效果良好的4种菌株为样本，通过测序获得的16SrDNA序列，通过NCBI网站进行Blast序列比对并构建系统发育树，如图2。序列对比发现Y+8与短波单胞菌(Brevundimonas)的一致性达到100%，7和10+8-20与芽孢杆菌(Bacillus)的一致性达到99%，Y+6与Aquamicrobium达到98%，通过系统发育树鉴定，Y+8为短波单胞菌、7为短小芽孢杆菌、10+8-20为芽孢杆菌、Y+6为Aquamicrobium。

2.4 生防菌接菌对高粱叶片活性氧的影响

2.5 生防菌接菌对高粱防御酶的影响

如图5可知，病原菌接菌后(多酚氧化酶)高粱叶片的防御酶PAL(苯丙氨酸解氨酶)与PPO(多酚氧化酶)活性均显著高于空白对照植株，且经生防菌Y+6、7、Y+8、10+8-20和病原菌接菌的高粱PPO酶的活性均显著高于单独病原菌接菌植株。如图5所示，F、Y+6、7、Y+8、10+8-20处理的PPO防御酶活性分别提高了0.024、0.115、0.138、0.144、0.137 U·g-1·min-1，其中生防菌7、Y+8、10+8-20三者之间无明显差异；PAL分别提高了0.227、0.32、0.553、0.207、0.453 U·g-1，其中生防菌7和10+8-20接菌的植株叶片PAL活性受到明显的诱导，与单独病原菌处理间差异达显著性水平，而Y+6、Y+8处理与病原菌单独处理的高粱植株之间无显著差异。

2.6 生防菌接菌对高粱抗氧化酶的影响

通过测定高粱发病后抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX的活性，如图6可知，与空白对照相比，病原菌接菌后植株的各抗氧化酶活性均显著升高，且4种生防菌接菌后，各处理植株的POD酶活性均显著高于单独的病原菌接种植株。与单独病原菌接种植株相比，生防菌Y+6、7、10+8-20接菌植株的SOD与APX酶活性也显著提高。而CAT酶活性显著降低，均显著低于单独的病原菌接菌植株，恢复至空白对照水平。其中单独病原菌接菌高粱的POD酶活性相比较CK提高了9 U·g-1，生防菌接菌高粱分别提高了62.44、36.51、108.29、65.88 U·g-1。

2.7 生防菌对高粱根际土壤酶活性的影响

本试验通过测定土壤脲酶、磷酸酶、多酚氧化酶、纤维素酶的酶活性来探讨不同生防菌对高粱根际土壤的影响，由图7可知，与空白对照相比，接菌病原菌后高粱根际土壤的4种土壤酶活性均显著升高，且接菌生防菌Y+6、7、Y+8、10+8-20后4种土壤酶活性显著高于单独接种病原菌的植株根际土壤酶活性。其中Y+8处理的土壤脲酶活性最高，且显著高于其他生防菌处理，10+8-20处理的根际土壤磷酸酶活性显著高于其他生防菌处理，7处理的根际土壤纤维素酶活性显著高于其他各生防菌处理，而多酚氧化酶在各生防菌处理之间差异未达显著性水平。

3 讨 论

本试验分离鉴定出4株对高粱枯萎病有明显拮抗效果的生防细菌(Aquamicrobium)、短小芽孢杆菌(Bacillus)、短波单胞菌(Brevundimonas)、芽孢杆菌(Bacillus)，并且通过调控高粱植株的抗氧化系统、防御酶系统以及高粱根际土壤酶活性等变化有效地抑制半裸镰刀菌的生长及高粱枯萎病的发生。本研究筛选的4株拮抗细菌均能够诱导高粱H2O2的产生，激活抗氧化系统，增强抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性以清除过量的活性氧，避免活性氧过度积累对植物造成损伤。刘丽霞等[17]关于拟南芥H2O2对大丽花黄萎病的早期防御反应的研究也表明，在植物病原体的向化作用下，活性氧有着多方面的作用，其不仅可激发植物的抗病系统，而且可诱导抗氧化酶活性的提高，清除活性氧，避免植株受到氧化胁迫损伤。

除此之外，本试验还发现4种拮抗细菌在抑制高粱枯萎病发生的同时均能显著提高其根际土壤的土壤酶活性，有助于良好的高粱根际土壤微生态环境的形成，为高粱生长创造更适宜的土壤环境条件。闫杨等[18]针对3株黄瓜枯萎病生防菌——芽孢杆菌的研究也发现生防菌的施入能够明显地提高黄瓜根际土壤磷酸酶、过氧化氢酶、脲酶等活性。本试验施入4种生防菌后，高粱根际土壤的脲酶、磷酸酶、多酚氧化酶、纤维素酶的酶活性均有显著的提高，与闫杨等的研究结果类似，说明生防菌还能通过提高土壤酶活性增强土壤肥力实现其防病促生作用。

在本试验的相关研究中，4种生防菌株均能够有效地提高抗氧化酶活性，很好地避免了活性氧的过量积累。其中“7”短小芽孢杆菌(Bacillus)与“10+8-20”芽孢杆菌(Bacillus)对植株抗氧化酶活性的促进效果与对枯萎病的生防效果最为明显。也有研究发现，芽孢杆菌可对多种病害起到生防作用，其可有效抑制西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、黄瓜立枯病菌等枯萎病的发生[19]。另外，李新等[20]通过黄瓜枯萎病的研究也发现POD、SOD活性的变化与黄瓜的抗病性呈正相关关系，侯茜[21]、孙正祥[22]等对西瓜枯萎病的研究还发现，POD和CAT活性与植物的抗病性呈正相关，这与本试验结果类似。另外，Xu等[23]关于花生白叶枯萎病的研究也发现，短小芽孢杆菌对枯萎病有显著的抑菌活性，在田间试验中达到65%以上，具有较好的生防作用。

已有研究表明，PAL和PPO活性可以作为反应植物抗病能力的主要生理指标，其中PPO可合成醌类物质使病原菌发生钝化，在植物受到病原菌侵害时发挥着重要的作用[24]。另有黄瓜枯萎病的生物防治相关研究发现，接种芽孢杆菌后植株PAL、PPO酶活性显著提高，促进了植物的生长和植物抗逆性的增强[9]。本试验也发现，与单独植物病原菌侵染相比，生防菌接种后植株的PAL、PPO酶活性均有显著的提高，有助于高粱枯萎病抗性的增强。

4 结 论

本研究通过拮抗细菌与半裸镰刀菌的拮抗试验与接菌试验，筛选并鉴定出4种拮抗细菌对半裸枯萎病有良好的生防效果，分别是Aquamicrobium、短小芽孢杆菌(Bacillus)、短波单胞菌(Brevundimonas)、芽孢杆菌(Bacillus),并且通过盆栽试验证明，4种生防菌可以有效地抑制高粱枯萎病的发生，提高植株胁迫抗性，诱导植物产生防御反应并增强植株根际土壤酶活性来提高植物抗病性，从而有效控制高粱枯萎病的发生，在高粱枯萎病的生物防治中具有潜在的应用前景。