鱼用基因工程疫苗的研究概况

江水清, 李婷, 张一楠, 黄晓红

(福建师范大学生命科学学院， 福建省发育与神经生物学重点实验室， 福州 350117)

鱼类含丰富的优质蛋白，在人类食谱中占重要地位。世界上80%的鱼产品被人类消耗[1]。我国人口众多、对鱼产品需求量大，但鱼类野生资源已趋于枯竭，食用鱼主要靠养殖。随着养殖规模和密度的扩大，鱼病暴发愈加频繁，导致化学药物大量使用，造成了水质恶化、水产品药物残余超标和病菌耐药等恶果，给鱼类养殖业带来巨大损失，严重制约了我国水产养殖业的健康发展。

研究表明，鱼类能对病原的攻击产生免疫反应，包括固有免疫反应(innate immunity)和获得性免疫反应(adaptive immunity)。感染了鳗弧菌(Vibrioanguillarum)MVAV6203株(鳗弧菌MVM425的aroC基因缺失株，自然条件下不表达毒力因子-鳗弧菌素)的河豚(Takifugurubripes)、斑马鱼(Daniorerio)、大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)体内的免疫相关因子包括IL-1β、TNF-α、MHC I与MHC II、CD8与CD4和IgM等都出现不同程度的上调或下调，这些细胞反应与用MVM425攻毒后的保护性免疫应答相关。攻毒结果显示，上述各种鱼的相对免疫保护率(relative percentage survival，RPS)都较高，分别为90.67%(河豚幼鱼)、80.31%(河豚成鱼)、80%(斑马鱼)和83%(大菱鲆)[2-5]。此外，MVAV6203使牙鲆(Paralichthysolivaceus)和斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)产生了100%的免疫保护率[6]。病原体的感染可刺激鱼体产生固有免疫应答和获得性免疫应答，使得鱼体在遭受病原体的再次感染时能产生更迅速和更强大的免疫反应，从而抵御病原体侵染，保护鱼体免受和少受伤害。目前，弱毒疫苗-鳗弧菌MVAV6203株已于2019年4月4日获得国内I类新兽药证书(〔2019〕新兽药证字15号)，获得生产上市许可(http://www.moa.gov.cn/)。因此对鱼病进行免疫预防具有理论基础和成功的实践。免疫预防既能增强鱼类抗病能力，又对环境无污染，且能保障水产食品安全，因而越来越受到人们的重视。

常用疫苗有传统疫苗和基因工程疫苗等，传统疫苗又包括灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗是指经理化方法处理失去了感染或复制能力，但仍保留抗原性的病原微生物。此类疫苗的安全性较高，但诱发细胞免疫效果较差，通常在预防病毒和胞内细菌感染方面效率较低，需要佐剂或多次加强免疫来诱导保护性免疫[7-9]。而弱毒疫苗是指通过理化方法或在异常条件连续培养传代的方法使病原致病性降低为弱毒力或自然低毒力，但仍有繁殖能力和免疫原性的病原微生物。其虽能有效地诱导细胞免疫，但可能存在毒力恢复、或因残余毒力太强而引起接种损失或污染环境等安全性问题，因此某些国家(比如日本)禁止水产养殖中使用弱毒疫苗[10-13]。此外，传统疫苗需要大量的病原微生物来制备。有的病原微生物难以或不能培养，导致缺乏稳定的抗原材料来源；有的病原微生物成分复杂，不易标准化生产和使用。因此开发鱼用基因工程疫苗迫在眉睫，以弥补传统疫苗之不足。

基因工程疫苗是利用重组DNA技术对抗原基因进行克隆和表达或修饰，并利用重组体本身或表达产物制备的疫苗，包括基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗、活载体疫苗以及突变疫苗或基因缺失疫苗4大类。因其操作简便，对渔业养殖环境无污染，有着广泛的应用前景。早在1988年，Gilmore等[14]研究表明，用重组表达的IHNV糖蛋白免疫虹鳟鱼，鱼体能产生一定的免疫保护作用，从此开启了鱼用基因工程疫苗研究的大门。

1 亚单位疫苗

基因工程亚单位疫苗(subunit vaccine)是指将病原体抗原表位与载体连接构建重组表达载体，利用原核或真核表达系统表达基因产物(重组多肽或重组蛋白)制备的疫苗。异源表达的重组亚单位疫苗既可以解决抗原供应和疫苗的安全性问题，又可以随时根据试验需要获得，还可以实现标准化生产和使用。鱼用亚单位疫苗研究中常用的表达系统主要包括大肠杆菌表达系统、真核表达系统和转基因植物表达系统。

1.1 大肠杆菌表达系统

大肠杆菌(Escherichiacoli)已被全基因组测序，遗传背景清晰，且被美国食品及药物管理局(U.S. Food and Drug Administration，FDA)批准为安全的基因工程受体生物。E.coli表达系统具有操作简便、成本低、产量高和技术成熟等优势，成为重组亚单位疫苗最常用的表达系统。

草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus，GCRV)能对草鱼(Ctenopharyngodonidellus)造成致命的出血性疾病，对草鱼养殖业造成灾难性的破坏。Pei等[15]利用大肠杆菌表达系统获得GCRV重组外壳蛋白rVP56，并从腹腔注射免疫鱼体。结果表明，rVP56的免疫使草鱼体内白细胞数量和抗体滴度均显著提高， GCRV攻毒后鱼的存活率显著高于对照组。推测VP56蛋白可能与GCRV病毒的入侵有关，有望作为草鱼抗GCRV感染的亚单位疫苗的靶点。

近年来，细菌性病原体也吸引了不少学者对其进行研究。Valderrama等[16]用大肠杆菌表达系统制备的美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida)的外膜蛋白rFrpA免疫塞内加尔鳎(Soleasenegalensis)，获得79.3%的免疫保护率。另外，以大肠杆菌重组表达的无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)的8种结构蛋白(rAP、rAL、rLivk、rESAT6、ressA、ressB、ressC和resaA)均能诱发罗非鱼(Oreochromisniloticus)产生保护性免疫反应，鱼体内TNF-α、IL-1β、IFN-γ、MHC-IIa、MHC-IIb和CD8α含量显著上调[17]。

目前，相对病毒和细菌性病原体，寄生虫重组亚单位疫苗的研究相对较少。He等[18]利用大肠杆菌重组表达多子小瓜虫(Ichthyophthiriusmultifilis)抑动抗原，致死剂量攻毒结果显示，受免鱼体的存活率达95%，而对照组的存活率仅为55%。另外，人们通过大肠杆菌重组表达了鲤吉陶单极虫(Thelohanelluskitauei)[19]和刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)[20]等寄生虫的抗原基因，但该重组蛋白能否激发鱼体产生有效的免疫保护作用尚未见报道。

原核表达系统的不足之处在于缺乏真核细胞所具有的蛋白质翻译后的修饰作用，如无法对重组蛋白进行糖基化修饰等，从而可能会影响重组蛋白的免疫活性。此外原核表达系统的表达产物容易在胞内形成包涵体，不易纯化。

1.2 真核表达系统

1.2.1酵母表达系统 酵母是真核单细胞生物，繁殖迅速，生长周期短，可实现大规模生产；能对分泌蛋白进行修饰，使肽链正确折叠成天然蛋白，重组蛋白更具生物活性；安全无毒，被公认为益生菌并作为一种食品添加剂，因此，适宜作为疫苗载体。酵母表达系统已成为仅次于大肠杆菌表达系统的第二大蛋白表达系统。在众多品质优良的酵母菌株中，被用于鱼用基因工程疫苗研究的主要有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)[21]和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)[22]3种类型。其中酿酒酵母在鱼用基因工程亚单位疫苗的研究中使用频率最高，详见表1。

表1 酿酒酵母表达系统在鱼类病原体重组蛋白制备中的应用Table 1 Expressions of the recombinant proteins of fish pathogens using Saccharomyces cerevisiae

酿酒酵母是第一个完成全基因组测序的真核生物，被欧洲药品管理局(European Medicine Evaluation Agency, EMEA)和FDA批准用于生产重组疗法所需的真核细胞微生物蛋白[30]。用表达CyHV-3的ORF131基因片段的重组酵母经口免疫鲤鱼，结果发现受免鱼体内的IFN-γ、 IFN-1β、 IFN-a1、 CXCa 、CXCL8-L1和抗体IgM的表达量上升，说明该重组酵母表达的rORF131不仅引起了促炎症因子的反应，也诱发了特异性抗体的生成，使得鲤鱼抗CyHV-3感染的能力显著提高，相对保护率达到53.33%[23]。同时，以CyHV-3的ORF65抗原基因制备的重组疫苗也具有免疫保护效应[31]。

但用酵母表达重组蛋白也存在一些不足之处，如发酵时间较长，可能含有不正确的蛋白糖基化，培养上清中多糖浓度较高，不利于纯化。这些局限性对酵母表达系统的发展有一定影响，因此，酵母表达系统仍然需要进行优化。

1.2.2昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统的载体为杆状病毒(Baculovirus)，受体细胞是昆虫细胞，如使用广泛的草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞系。含有外源基因的重组杆状病毒能在昆虫细胞内进行基因组的自我扩增，并实现外源基因的表达。

Lecocq-Xhonneux 等[32]于1994年将昆虫细胞表达系统用于鱼用亚单位疫苗的研究。他们用Sf9细胞表达的重组VHSV G蛋白注射免疫虹鳟鱼，增强了虹鳟鱼抗VHSV感染的能力，相对保护率达80.2%。而Standish等[33]用含VHSV亚型VHSV-IVbG基因的杆状病毒感染粉纹夜蛾(Cabbagelooper)幼虫，用纯化后的重组G蛋白免疫北美狗鱼(Esoxmasquinongy)，受免鱼抗VHSV能力提高，RPS达80%。

昆虫细胞表达系统的优势在于：杆状病毒的宿主专一性强，安全性高；具有重组蛋白翻译后加工的机制，使得重组蛋白的活性及抗原性等更接近天然蛋白；载体可容纳大分子插入片段等。因此，昆虫细胞表达系统常用于重组亚单位疫苗的研究。但昆虫细胞重组表达的外源蛋白糖基化方式和哺乳动物相比仍然存在一定差异。

1.2.3四膜虫表达系统 嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)是一种真核单细胞模式生物，遗传背景清晰，且功能的保守性高于酵母。四膜虫可无菌纯培养，易于在廉价的培养条件下快速生长(每代2～2.5 h)繁殖到高密度。因此在具备四膜虫基因操作技术和虫种保藏技术后，研究人员开发了四膜虫表达系统，并认为该系统适宜用于工业化生产外源蛋白。更重要的是，一些鱼类寄生纤毛虫(如刺激隐核虫和多子小瓜虫)与四膜虫一样，用UAA和UAG(通用的终止密码子)编码谷氨酰胺，因此，它们的基因无法在常规的表达系统中表达，但四膜虫表达系统可直接表达以上两种病原的基因，获得更接近于天然结构的重组蛋白。

Mo等[34]利用T.thermophila重组表达的C.irritans的抑动抗原rGDCI3 I-antigen免疫橙点石斑鱼(Epinephelusbleekeri)后发现，这些鱼的血清抗体IgM高于磷酸盐缓冲液(PBS)对照组，且rGDCI3 I-antigen免疫组的累积保护率为25%，显著高于对照组。另外，以T.thermophila重组表达的I.multifilis抑动抗原Iag的免疫原性良好，能使欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)产生有效的免疫保护作用[35]。

目前四膜虫表达系统常用的启动子为T.thermophila金属硫蛋白编码基因(MTT1)的启动子，需要Cd2+作为诱导剂[34-37]，而Cd2+为重金属离子，对动物和人的毒性较大，且会污染环境。因此，利用该表达系统表达外源蛋白，会引发环境污染和水产品食品安全问题，严重制约了四膜虫表达系统的发展和应用。于是Yu等[38]以T.thermophila细胞质热休克蛋白编码基因Hsp70-2作为启动子，经热休克诱导而实现了绿色荧光蛋白GFP在四膜虫中重组表达。与MTT1启动子相比，Hsp70-2启动子的转录效率显著增强。同时，以Hsp70-2作为启动子，且基于T.thermophila小核rDNA改造得到pD5H8载体，热诱导后得到大量具有生物活性的重组抗原[39-40]。而Üstüntanr Dede等[41]以Hsp70-2基因、rDNA复制起始点和端粒序列构建了第一个大核人工染色体，并在四膜虫体内实现GFP的重组表达。另外，以嘌呤霉素抗性基因作为重组表达载体的筛选标记能提高重组T.thermophila的筛选效率[42]。

以上结果表明，以Hsp70-2基因作为启动子解决了重金属离子Cd2+带来的污染问题，且实现外源基因在T.thermophila中的高效表达，这对四膜虫表达系统应用于鱼用基因工程疫苗研究具有重要意义。然而，Hsp70-2存在转录活性受热休克抑制的缺陷[38]，因此还需进一步研究并优化。由此可见，寻找更安全和高效的启动子和诱导剂完善四膜虫表达系统是今后的重要任务。

1.2.4转基因植物表达系统 目前，在鱼类基因工程疫苗研究领域，利用根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导或微粒轰击等方法使外源基因和植物核基因组整合，实现外源基因在转基因植物中的重组表达。Shin等[43]以重组表达虹彩病毒(Iridovirus)衣壳蛋白(MCP)的转基因水稻愈伤组织喂食条石鲷，攻毒结果显示，对照组全部死亡，而免疫组的存活率为80～90%。表明该重组愈伤组织能对条石鲷起到有效地抵抗虹彩病毒攻击的免疫保护作用，说明该MCP可能在虹彩病毒侵染宿主过程中起重要作用，可作为疫苗的候选基因。

近年来利用藻类来表达外源蛋白的技术逐渐受到人们的关注。用藻类表达外源蛋白，培养周期较转基因植物短，可以完成复杂的蛋白折叠，形成有活性的重组外源蛋白；且有的藻类能被动物直接食用，从而降低纯化成本。Shahin等[44]首次用硅藻(Diatom)重组表达了东方弗朗西斯菌(Francisellaorientalis，Fo)的一种热休克蛋白(GroEL)和外膜蛋白(IglC)，免疫罗非鱼后结果表明，rGroEL或rIglC免疫增强了尼罗罗非鱼抵御Fo的能力，受免鱼的RPS达53～75%。除硅藻外，有报道显示莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)也可作为外源基因重组表达载体[45]。

植物细胞的细胞壁可保护目标抗原蛋白免受动物胃部消化或者降解，除此之外，植物表达系统还具有成本低、适合大规模生产、安全无毒等特点，而且能对抗原进行翻译后的修饰，从而保证其抗原性。但转基因植物表达系统操作费时，目标蛋白表达量较难提高，且分离纯化难度较大。

1.3 病毒样颗粒亚单位疫苗

近年来，随着生物技术的发展，病毒样颗粒(Virus-likeparticles，VLPS)疫苗得到发展。作为一种新型的基因工程疫苗，VLPS疫苗是亚单位疫苗的一种，但和重组亚单位疫苗又有所不同，它的特点是：①不具传染性，安全可靠；②有很好的免疫效应；③不含核酸，不能自主复制；④疫苗大小合适，是很有前景的基因工程疫苗[46-47]。以本氏烟草(Nicotianabenthamiana)和烟草BY-2细胞表达并组装的神经坏死病毒样颗粒(NervousNecrosisVirus-likeParticles，NNV VLPs)在冷冻电镜下呈直径20～30 nm大小的二十面体球状三维结构，对欧洲舌齿鲈(Dicentrarchuslabrax)有一定的免疫保护效果，RPS为63.6～86.5%[48]。

亚单位疫苗因不含病原的毒力因子，安全性高，成分简单明了、稳定性较好，有利于标准化生产和使用，成为理想的基因工程疫苗。其关键在于筛选到高效的靶标基因及选择合适的表达系统。目前真核表达的重组蛋白抗原性相对较好，但有些代价较高(如昆虫细胞表达系统)，不利于大规模生产。原核表达系统操作简便、技术成熟、成本低，但有些重组蛋白的免疫原性较差。因此一些研究者对佐剂进行深入研究，如Tang等[49]以牙鲆的白介素2(Interleukin-2 ，IL-2)作为佐剂与重组表达的爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)外膜蛋白V(OutermembraneproteinV，OmpV)混合后免疫牙鲆，攻毒后的结果显示，混合蛋白免疫组的RPS达71%，而rOmpV免疫组仅为40%，说明牙鲆的IL-2分子有作为提高基因工程亚单位疫苗免疫效果的佐剂潜能。

自1988年第一次发现重组蛋白能增强虹鳟鱼的免疫保护作用以来[14]，人们对基因工程疫苗在鱼病的免疫防治方面的研究已有32个年头。但直至目前，商品化亚单位疫苗仍然数量不多，仅以IPNV的G蛋白VP2和 VP3片段制备的亚单位口服疫苗在美国和加拿大获准上市；以VP2制备的亚单位注射接种疫苗在加拿大、挪威和智利获准上市[50]；以SVCV G蛋白制备的亚单位注射接种疫苗在比利时获准上市[50]。由此表明，鱼用基因工程亚单位疫苗仍有很大的发展空间，需要进一步的深入研究和实践。

2 DNA疫苗

DNA疫苗通过将携带有编码所选抗原蛋白的特定基因的重组真核表达质粒注入宿主体内，使其在宿主体内表达抗原蛋白，从而刺激诱发宿主产生免疫应答。1996年，Anderson等[51]制备了含IHNVG基因的DNA疫苗pCMV4-G，通过肌肉注射免疫虹鳟鱼，增强了虹鳟鱼抵御该病毒感染的能力，从而开启了鱼用核酸疫苗的应用研究。IPNV和IHNV 均易引发鲑鱼的高致死率。研究发现，IPNV的VP2基因具有很好的免疫原性[52]。Ahmadivan等[53]用重组真核表达质粒pcDNA3.1-VP2免疫虹鳟鱼，发现pcDNA3.1-VP2免疫鱼血清抗体能识别IPNV，该抗体能持续长达90 d。在攻毒后免疫鱼的RPS为76.45～88.23%。病毒性出血性败血症病毒(Viralhemorhagicsepticemiavirus，VHSV)是单链 RNA 病毒，结构简单，是目前研究较多的病原体之一。Standish等[54]发现,VHSV亚型VHSV-IVb 的DNA疫苗pVHSivb-G对北美狗鱼、虹鳟、褐鳟(Salmotrutta)和湖鳟(Salvelinusnamaycush)等四种鱼抵御该病毒感染的能力显著提高。

对细菌和寄生虫性鱼病的DNA疫苗研究也有报道。鳗弧菌是三大致病弧菌之一，宿主广泛，危害严重。Xing等[55]以鳗弧菌VAA基因构建重组质粒pcDNA3.1-VAA并用于肌肉注射免疫牙鲆，结果发现,免疫鱼肌肉组织中检测到VAA蛋白的表达，且鱼体内sIgM+、CD4-1+、CD4-2+和CD8β+等淋巴细胞数量显著增加；攻毒后免疫鱼的RPS为50%。即pcDNA3.1-VAA可能是一种良好的疫苗候选物，能增强牙鲆对鳗弧菌感染的抵御。Xu等[56]用多子小瓜虫抑动抗原构建了DNA疫苗，发现能显著提高斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)的特异性抗体水平，当剂量为10 μg·条-1时，受免鱼体的RPS为20%；当用剂量为20 μg·条-1时，或10 μg·条-1的剂量接种2次，能使受免鱼的RPS分别达到35.6%和48.9%[57]。Josepriya 等[58]用刺激隐核虫抑动抗原制备的DNA疫苗免疫斜带石斑鱼，发现石斑鱼抗刺激隐核虫感染的能力增强。攻毒剂量分别为1 000、1 300和1 500幼虫数·g-1时，免疫石斑鱼的RPS分别为100%、 96%与15%，说明该DNA疫苗对鱼体起到一定的免疫保护作用，但免疫保护程度随攻毒强度存在差异。

与传统疫苗相比，DNA疫苗仅编码单一的病原体基因，DNA分子稳定、安全，基本不存在毒性逆转的现象。但DNA疫苗还不够成熟，目前，无法确定宿主基因组是否会与外源DNA整合，从而打破宿主体内癌基因和抑癌基因的平衡。另外，Dalmo等[59]认为,DNA疫苗存在潜在的副作用，包括机体对表达抗原的免疫耐受性、染色体整合和注射部位炎症等。近年来，除了DNA疫苗，另一类鱼用核酸疫苗——RNA疫苗也引起人们的关注。RNA疫苗具有许多优点，如RNA不具感染力，可通过正常细胞过程降解，不存在感染或插入诱变的潜在风险。针对鱼用RNA疫苗的研究，Wolf等[60]发现，将载体—鲑鱼甲病毒(Salmonidalphavirus)与传染性鲑贫血病毒(Infectioussalmonanemiavirus，ISAV)血凝素脂酶基因连接而制备的RNA复制子疫苗能刺激大西洋鲑鱼(Salmosalar)产生抗体和炎症因子，有效抵抗ISAV的感染，大西洋鲑鱼的RPS为69.2%。由此表明,RNA疫苗在鱼用疫苗有着光明的应用前景。

目前，国外已有数种DNA疫苗获准上市，2003年，针对IHNV制备的DNA 疫苗在英国哥伦比亚通过审批，是全球首个获执照许可的DNA 疫苗[61]，且2005年在加拿大获准上市[62]；2018年，防御鲑胰腺病病毒(Salmonpancreaticdiseasevirus，SPDV)的DNA 疫苗在挪威和欧盟获准上市[54]。

3 活载体疫苗

活载体疫苗(live vector vaccine)指将病原体的抗原基因和非致病性病原体基因进行整合后构成的重组活载体疫苗。活载体疫苗具有以下优点：①效力高、成本低、对环境安全无毒；②可制备多价疫苗或多联疫苗，从而起到一针防多病的效果。目前，活载体疫苗在鱼用疫苗上的研究主要包括细菌活载体疫苗和病毒活载体疫苗。

3.1 细菌活载体疫苗

细菌活载体疫苗在鱼用活载体疫苗研究中较多。目前，用于鱼用细菌活载体研究的有：爱德华氏菌[63]、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)[64]、大肠杆菌[65]和一些益生菌微生物等。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)均为益生菌，安全无毒，能促进肠道更好地吸收营养物质，增强机体免疫力，两者均可作为载体表达外源蛋白。以携带维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)flaB基因或OmpAI基因的重组干酪乳杆菌免疫锦鲤(Cyprinuscarpio)，维氏气单胞菌攻毒后，对照组鱼体全部死亡，免疫组的RPS大于50%[66-67]。另外，有研究表明，用乳酸乳球菌和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)构建的重组活载体疫苗也能引发宿主产生保护性免疫反应[68-73]。

3.2 病毒载体疫苗

现阶段对病毒活载体疫苗的研究较少。病毒活载体疫苗的载体一般为减毒株，将外源抗原插入到载体基因组的非必要区形成重组的新病毒，外源基因随载体的复制而表达。目前，用于鱼用病毒活载体研究的有杆状病毒(Baculovirus)、腺病毒(Adenovirus)和IHNV等。Li等[74]利用腺病毒包装技术得到大量高滴度的IHNVG基因过表达的腺病毒活载体疫苗，免疫虹鳟鱼后结果显示，疫苗免疫组鱼体的致死率为8%，远远低于对照组100%死亡率，且其免疫相关基因和抗体滴度水平显著升高，RPS达92%，说明该腺病毒活载体疫苗能使虹鳟鱼抵御IHNV感染的能力增强，有作为候选疫苗的潜力。另外，最新研究发现，杆状病毒和IHNV均能作为疫苗载体，引发宿主有效的免疫保护作用[75-76]。

4 基因缺失疫苗或突变疫苗

基因缺失疫苗或突变疫苗是指病原体的某致病基因中的一段序列发生突变或缺失形成的减毒株疫苗。这类疫苗使用有活性的减毒微生物，能在宿主体内长时间发挥作用并诱导强烈免疫反应，整个过程无需添加佐剂且成本较低。

Vaughan等[77]最早进行鱼用基因突变疫苗研究，结果表明,减毒型杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida) 能作为良好的抗原激活鱼类免疫系统，引发特异性免疫反应。减毒的爱德华氏菌是目前在基因突变疫苗研究中应用较多的抗原之一，以野生型爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system，T3SS)的四个结构蛋白基因缺失株EpDssaV、EpDesaM、EpDyscR和EpDescT免疫鲶鱼(Silurusasotus)后发现，基因缺失株的毒力降低，对鲶鱼的致死率为0～16%，显著低于野生株的致死率(26%)，免疫后鲶鱼产生了100%的免疫保护率[78]。另外，使爱德华氏菌T3SS的其他基因发生突变也能降低爱德华氏菌的毒性，刺激宿主产生有效的免疫保护作用[79-80]。

目前，国外还没有获准商品化的基因突变疫苗。而国内，aroC基因欠缺的鳗弧菌弱毒活疫苗(MVAV6023株)已获得生产上市许可，这也是目前国内唯一获得生产许可的鱼用基因工程疫苗[3, 6, 81]。虽然基因突变疫苗免疫原性较高，能较好地刺激鱼体产生保护性免疫效应，但基因突变疫苗也存在一些缺点，如疫苗含有一定残余的毒力，可能引起宿主死亡；且疫苗可能会由于“毒力返祖”现象引发交叉感染。

5 存在问题及展望

鱼用基因工程疫苗确实能对宿主起到有效的免疫保护作用，但用于实际生产和应用的疫苗种类并不多。目前，为数不多的商品化鱼用基因工程疫苗主要是亚单位疫苗和DNA 疫苗，活载体疫苗还未见有商业化产品。基因突变疫苗虽然免疫原性良好，但存在疫苗稳定性和安全性问题；活载体疫苗免疫效果良好，成本低，可诱导宿主产生较广泛的免疫反应，包括黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫等，但由于缺乏稳定和持续高表达的异源基因表达系统，因此制约了活载体疫苗的发展。

亚单位疫苗免疫后宿主体内抗体出现时间早、副作用少，但蛋白纯化工艺成本较高，重组后表达的抗原免疫原性较弱、持续性较差。与亚单位疫苗相比，DNA 疫苗制备简便，能在宿主体内长时间持续引发强烈的免疫反应，免疫效果显著。Sun等[82-83]对亚单位疫苗和DNA疫苗在鱼体诱发的免疫应答进行比较发现，DNA疫苗能够同时诱发鱼体的细胞和体液免疫应答，而亚单位疫苗主要诱发鱼体的体液免疫应答。Embregts等[84]制备了SVCV的DNA疫苗pcDNA3-SVCV-G，同时利用昆虫细胞Sf21制备亚单位疫苗bAc-SVCV-G，分别用两种疫苗免疫欧洲鲤鱼(Cyrpinuscarpiocarpio)后，DNA疫苗免疫组鱼体能获得90%的存活率，而亚单位疫苗免疫组的存活率仅为5～30%。另外，Pumchan等[85]制备了编码无乳链球菌多个肽段的DNA疫苗(pcDNA3.1-42E2和pcDNA3.1-45F2)和经大肠杆菌重组表达的亚单位疫苗(r42E2和r45F2)分别免疫尼罗罗非鱼后发现，DNA疫苗免疫组的RPS显著高于亚单位疫苗免疫组。但Xing等[55, 86]制备了鳗弧菌VAA基因的DNA疫苗pcDNA3.1-VAA和经大肠杆菌表达的亚单位疫苗rVAA免疫牙鲆后发现，亚单位疫苗免疫组牙鲆的RPS显著高于DNA疫苗免疫组。由此推断可能和接种疫苗的剂量、抗原基因本身的免疫原性、接种方式和次数、以及佐剂的使用和环境条件等因素的影响有关。通过Collins[87]和Dalmo[59]对鱼用DNA疫苗的研究表明，目前针对抗原成分相对简单的病毒性病原体的鱼用DNA 疫苗研究较多，抗原片段多数为编码病毒外壳蛋白的结构成分。

我国水产养殖业日益发展和人们对健康鱼产品的需求，推动着我国鱼用疫苗的研究和发展。到目前为止，针对GCRV、爱德华氏菌、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和鳗弧菌等病原体，国内已有7款鱼用疫苗获得批文并正式上市[81]。但仅有鳗弧菌弱毒活疫苗为鱼用基因工程疫苗，其他6款鱼用疫苗均是以注射方式接种的非基因工程疫苗。基因工程疫苗的数量少且种类单一，可能是由于基因工程疫苗还存在以下问题。①基因工程疫苗本身亦存在安全性问题，如：整合到宿主染色体的DNA疫苗有可能激活癌基因的表达；大规模疫苗生产过程中的安全性控制问题等。由此可见，生物安全问题是影响我国鱼用基因工程疫苗发展的一个重要因素。②现阶段，人们对鱼体免疫系统的作用机制和一些病原体的致病机理了解还不够清晰。③国外的鱼用疫苗在研发、生产和应用过程已形成了一套完整的产业链，技术较为成熟[88]，而我国鱼用疫苗研究大多处于基础研究水平，实用型疫苗研发能力有待进一步提高，研发与生产存在脱节现象。

随着我国水产养殖业日益发展，越发多样复杂的病害给养殖业造成巨大的经济损失。物理化学方法的防治会使鱼体内残余化学药物超标，影响人体健康；药物的长期使用或滥用会破坏生态平衡。正所谓挑战与机遇并存，现代生物科学技术和水产养殖业的迅速发展，为我国鱼用基因工程疫苗的研制、开发以及商业化发展创造了机会。因此，在基因工程疫苗研发模式上，我国应逐渐与国外接轨，加强企业与研究所或高校的合作；增加研发资金的投入，利用转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多种组学和现代分子生物学技术对鱼体抗病原体感染关键基因与病原体致病因子开展生物学功能与作用机制的研究，采用多学科相结合的方法综合分析病原体的遗传机制，增强我国鱼用基因工程的研发能力。如Ngo等[89]对英国的315种嗜冷黄杆菌(Flavobacteriumpsychrophilum)的遗传多样性进行分析，为疫苗的开发提供了重要的流行病学数据。促进鱼用基因工程疫苗的产业升级，使其发展轨道规范化、标准化和法制化，努力健全鱼用基因工程疫苗的安全评价体系，简化产品的注册审批流程，加快疫苗从实验室走向商品化的步伐。

基因工程疫苗是疫苗发展史上一次新的革命，是一种有前景的防治方法。通过基因工程手段筛选出强免疫原性的抗原并研制出有效疫苗被视为防治病原体感染的有效途径之一，从而减少对养殖生态的破坏，使水产养殖健康发展、食品安全得到保障，对进一步创造和发展良好的经济与社会效益具有重要意义。随着生命科学技术高速发展及其在疫苗研制上的应用，及对鱼免疫系统和病原体感染机制的了解和加深，高效、稳定和安全的鱼用基因工程疫苗将被深入研究与广泛应用，为水产养殖业的绿色发展提供安全保障。